為加強醫(yī)院病原微生物實驗室生物安全管理工作，確保醫(yī)院平安目標(biāo)的實現(xiàn)，我院檢驗科根據(jù)xxxx省《病原微生物實驗室生物安全管理條例》的相關(guān)內(nèi)容，對醫(yī)院實驗室安全管理工作進(jìn)行了自查，對涉及病原微生物菌(毒)種及樣本的人員進(jìn)行了培訓(xùn)，提高他們生物安全的意識，掌握必要的生物安全知識。

　　一、實驗室生物安全管理工作、各項規(guī)章制度的運行情況

　　醫(yī)院檢驗科根據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行學(xué)習(xí)，并定期對有關(guān)生物安全各項規(guī)章制度的運行情況進(jìn)行檢查，對存在的問題及時進(jìn)行整改。實驗室所從事的實驗活動均嚴(yán)格遵守有關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)和實驗室技術(shù)規(guī)范、操作規(guī)程，并指定專人監(jiān)督檢查實驗室技術(shù)規(guī)范和操作規(guī)程的落實情況。同時，對檢查情況進(jìn)行詳細(xì)記錄，定期召開會議討論工作中發(fā)現(xiàn)的問題，及時糾正。

　　二、病原微生物菌(毒)種的管理及運輸

　　因各方面條件限制我院現(xiàn)不能開展病原微生物實驗室生物的檢查，根據(jù)通知要求積極組織相關(guān)人員主要學(xué)習(xí)了：病原微生物實驗室菌(毒)種的管理嚴(yán)格登記制度，收到菌(毒)種后立即進(jìn)行編號登記，詳細(xì)記錄菌(毒)種的名稱、來源、特性、用途、批號、傳代日期、數(shù)量。在菌(毒)種的管理，安全保衛(wèi)制度，安全保衛(wèi)措施，保管過程中，傳代、分發(fā)及使用，均應(yīng)及時登記，定期核對庫存數(shù)量。菌(毒)種在進(jìn)行銷毀時，滅菌指示標(biāo)志，滅菌效果，同時做好銷毀登記等內(nèi)容。

　　三、實驗室生物安全突發(fā)事件的處理工作

　　在此次自檢中，我院實驗室對以前制訂的處置意外事件的應(yīng)急指揮和處置體系，進(jìn)一步進(jìn)行了修訂，使之能滿足實際工作的需要。

　　針對當(dāng)發(fā)生自然災(zāi)害(如地震、水災(zāi)等)或設(shè)施出現(xiàn)故障時，我們制定了可能遇到的緊急情況及其處理原則。

　　同時規(guī)范了菌(毒)種外溢在臺面、地面和其他表面的'的處理原則、皮膚刺傷(破損)的處理原則、離心管發(fā)生破裂的處理原則并建立了意外事故報告制度。

　　在實驗室的顯著位置張貼了實驗負(fù)責(zé)人、實驗室工作人員、消防、醫(yī)院、公安、工程技術(shù)人員、水、電氣維修部門電話。

　　四、提高意識，加強學(xué)習(xí)

　　組織檢驗人員對《病原微生物實驗室生物安全管理條例》進(jìn)行全面系統(tǒng)的學(xué)習(xí)，同時加強了實驗室的準(zhǔn)入制度的管理，標(biāo)明實驗室類型、負(fù)責(zé)人及其聯(lián)絡(luò)方式。加強了個人安全防護(hù)，并要求檢驗人員嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程進(jìn)行檢驗。

　　通過這次對微生物實驗室生物安全管理工作自查，提高了全體檢驗人員對微生物實驗室生物安全管理工作重要性的認(rèn)識，加強管理，采取有效措施，確保實驗室工作安全。

微生實驗報告3

　　一、實驗?zāi)康?/strong>

　�。ㄒ唬┱莆找话闩囵B(yǎng)基的制備原理及要求，掌握培養(yǎng)基酸堿度的測定，熟悉一般培養(yǎng)基的制備過程和各種器皿滅菌方法。

　�。ǘ�）掌握細(xì)菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)和方法，掌握細(xì)菌抹片的制備方法和革蘭氏染色法及油鏡的使用方法，并認(rèn)識革蘭氏染色的反應(yīng)特性。

　�。ㄈ�）掌握學(xué)習(xí)用微生物學(xué)原理診斷疾病的一般方法及步驟。

　　二、實驗用品

　　（一）器材

　　量筒、燒杯、電子天平、漏斗、三角燒瓶、空試劑瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、ph試紙、紗布、脫脂棉、天平、電爐、試劑瓶瓶塞、扎繩、放大鏡、包裝紙、洗耳球、酒精燈、載玻片、火柴、吸水紙、剪刀、記號筆、接種環(huán)、注射器、鑷子、鉗子、毫米尺、培養(yǎng)箱、水浴培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、油鏡

　�。ǘ�）試劑及材料

　　肘胨、蛋白胨、豬膽鹽、氯化鈉、瓊脂、乳糖、0.01%結(jié)晶紫水溶液、0.5%中性紅水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氫氧化鈉、鹽酸、牛血清、革蘭氏染色液、蒸餾水、小白鼠、病豬內(nèi)臟

　　三、實驗步驟

　�。ㄒ唬┡囵B(yǎng)基的制備

　　（所有用到的器皿都已121℃高壓滅菌15~30min，傾注平板在無菌操作臺內(nèi)完成，并放在無菌操作臺內(nèi)）

　　1、麥康凱培養(yǎng)基

　�。�1）組成：蛋白胨17g、肘胨3g、豬膽鹽5g、氯化鈉5g、瓊脂17g、乳糖10g、0.01%結(jié)晶紫水溶液10ml、0.5%中性紅水溶液5ml、蒸餾水1000ml

　　（2）方法：將蛋白胨、肘胨、豬膽鹽和氯化鈉溶解于400ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph至7.2。將瓊脂加入600ml蒸餾水中，并加入乳糖，加熱熔化。將兩液混合，分裝于燒瓶內(nèi)，用紗布、扎繩等捆好后，121℃高壓滅菌15~30min。待冷卻至50~ 55℃時，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。

　　注：結(jié)晶紫和中性紅水溶液配好后需經(jīng)高壓滅菌。

　　2、血清平板

　�。�1）組成：營養(yǎng)瓊脂、牛血清

　�。�2）方法：將滅菌的營養(yǎng)瓊脂加熱熔化，冷卻至45~50℃時，加入牛血清，并混勻，傾注平板。

　　注：不得將牛血清一并加入后再滅菌。

　　3、lb培養(yǎng)基

　�。�1）組成：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g

　　（2）方法：在950ml蒸餾水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、瓊脂和氯化鈉，調(diào)節(jié)ph至7.4，加熱熔化，分裝于瓶中，用紗布、扎繩等捆好后，121℃高壓滅菌15~30min。待冷卻至50~ 55℃時，傾注平板。

　　4、液體培養(yǎng)基（在lb培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，裝入大試劑瓶中，不加瓊脂，不分裝）

　�。ǘ�）病料取材

　　在病豬死亡后，首先用顯微鏡檢查其末梢血液膜片中是否有炭疽桿菌存在，未發(fā)現(xiàn)，則立即用消毒的器械對其進(jìn)行生理解剖，觀察其病理特征現(xiàn)象，取出病豬的十二指腸、胃、肝臟三處的組織物，并注意組織的完整性，用儲物袋密封保存。

　�。ㄈ�）細(xì)菌粗培養(yǎng)

　　1、消毒滅菌：操作人員先用消毒水清洗手或戴好實驗手套，再用消毒水對無菌操作臺內(nèi)桌面及用酒精燈外焰對待用器械進(jìn)行火焰滅菌。

　　2、接種

　�。�1）在無菌操作臺酒精燈旁打開用儲物袋密封保存的病料，先左手持鑷子右手持剪刀，把病料剪出一個小口。

　�。�2）右手持滅過菌的接種環(huán)，左手持平板，并用拇指、食指及中指將平皿揭開約20左右，然后將接種環(huán)前端插入小口旋轉(zhuǎn)一下后，再用劃線接種的方法接種到一個血清平板上。

　　（3）用記號筆在平板底部作好日期、操作人員、部位等標(biāo)記，并將平板倒放。

　　以此方法，分別接種十二指腸、胃粘膜、肝臟于血清平板上，各接種2個血清平板。

　　3、培養(yǎng)：將接種好的血清平板倒扣放入37℃培養(yǎng)箱中，反向培養(yǎng)24小時。注：劃線接種時盡量劃開，以保證長出單個菌落，且劃線時接種環(huán)應(yīng)盡量傾斜，以免劃破培養(yǎng)基（后同）；待接種完畢后熄滅無菌操作臺內(nèi)酒精燈，關(guān)閉好無菌操作臺窗口，打開無菌操作臺內(nèi)的紫外燈。 。

　�。ㄋ模┘�(xì)菌純培養(yǎng)

　　1、菌落特征判斷

　　待粗培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)24小時后，取出用放大鏡觀察記錄單個小菌落的形態(tài)特征并用實驗報告紙記錄好，并在平板底部上做好觀察標(biāo)記，其形態(tài)特征包括大小、形狀、菌落邊緣、表面構(gòu)造、隆起度、濕潤度、透明度、顏色等。

　　2、取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢

　�。�1）取干凈的載玻片，用記號筆在其一面做好正反面標(biāo)記，再在載玻片另一面中央滴上一小滴蒸餾水。

　　（2）將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷卻后，在酒精燈旁從標(biāo)記的`單個小菌落中取少許細(xì)菌置于蒸餾水中混勻（同時蓋好平板倒扣置于一旁），用接種環(huán)涂成直徑約1.5cm的菌膜，再在酒精燈火焰上方以鐘擺速度通過固定好細(xì)菌，待冷卻進(jìn)行染色。

　�。�3）先滴加草酸結(jié)晶紫溶液染色1~2min，再水洗；然后滴加革蘭氏碘液溶液染色1~2min，再水洗；隨后滴加95%的酒精脫色30~60s，再水洗；最后滴加稀釋的品紅進(jìn)行復(fù)染30~60s，再水洗；待干燥或吸水紙吸干后鏡檢。

　�。�4）將干燥的載玻片放在1000倍油鏡下，滴加一滴松柏油進(jìn)行鏡檢，觀察其形態(tài)特征，判斷細(xì)菌的種屬。

　　3、細(xì)菌接種培養(yǎng)

　�。�1）消毒滅菌：操作人員先用消毒水清洗手或戴好實驗手套，再用消毒水對無菌操作臺內(nèi)桌面及用酒精燈外焰對待用器械進(jìn)行火焰滅菌。

　�。�2）接種：右手持滅過菌的接種環(huán)，左手持平板，并用拇指、食指及中指將平皿揭開約20左右，然后將接種環(huán)插入揭開的平板口內(nèi)蘸去一下鏡檢標(biāo)記的小菌落，再用劃線接種的方法接種到一個血清平板、lb平板或麥康凱平板上。并用記號筆在平板底部作好日期、操作人員、菌種、部位等標(biāo)記，將平板倒放。

　　（3）將接種好的平板倒扣放入37℃培養(yǎng)箱中，反向培養(yǎng)24小時。

　　注：油鏡用完后應(yīng)立即清理物鏡上的松柏油；劃線接種時盡量劃開，以保證長出單個菌落；待接種完畢后熄滅無菌操作臺內(nèi)酒精燈，關(guān)閉好無菌操作臺窗口，打開無菌操作臺內(nèi)的紫外燈。 。

　�。ㄎ澹┚�液的制備

　　1、鏡檢：用革蘭氏染色法在1000倍油鏡下鏡檢，觀察并記錄是否為純培養(yǎng)的細(xì)菌。

　　2、分裝液體培養(yǎng)基：先對無菌操作臺及需要使用的器械進(jìn)行消毒滅菌，然后用鉗子揭開一個空試劑瓶，用傾倒的方法在酒精燈旁從液體培養(yǎng)基大試劑瓶中分裝于空試劑瓶內(nèi)，并立即蓋上液體培養(yǎng)基大試劑瓶瓶塞。

　　3、接種：右手持接種環(huán)，用火焰對其進(jìn)行滅菌，待冷卻后，取出純培養(yǎng)的平板，在無菌操作臺內(nèi)酒精燈旁，蘸去少許細(xì)菌，左手傾斜液體培養(yǎng)基，將接種環(huán)，伸入液體培養(yǎng)基內(nèi)攪動，然后取出對接種火焰環(huán)滅菌，并用滅菌的包裝紙捆綁好后，用記號筆做好相應(yīng)標(biāo)記，置于一旁。

　　4、培養(yǎng)搖菌：將接種好的液體培養(yǎng)基置于水浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。注：分裝一個培養(yǎng)基就接種一個培養(yǎng)基，不得全部分裝完后再一個一個接種。

　�。�六）小鼠致病性實驗

　　1、保定：選擇健康的青壯年小白鼠，先用右手抓住尾巴，旋轉(zhuǎn)數(shù)周讓其眩暈，然后用左手的拇指和食指捏住兩耳及頭部皮膚，并翻轉(zhuǎn)左手，使其頭部朝下，以達(dá)到內(nèi)臟前移的目的。

　　2、接種：先用酒精棉球蘸取酒精對注射部位擦洗消毒，再用注射器注射吸取0.2ml菌液注射于小白鼠腹腔中。

　　3、觀察：將接種的小白鼠放在適宜的環(huán)境下生活，并在鼠籠處用記號筆標(biāo)記好接種時間、菌種等。

　　4、再培養(yǎng)鑒定：待小白鼠死亡后，對其進(jìn)行解剖，觀察其內(nèi)臟病變情況，并取肝臟直接涂在相應(yīng)培養(yǎng)基上，在適宜條件下反向培養(yǎng)24小時后，取菌落細(xì)菌進(jìn)行鏡檢觀察判斷。

　　注：在注射小白鼠2小時候需要觀察小白鼠是否因注射時傷害到內(nèi)臟而死亡。

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