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dna粗提取和鑒定
dna粗提取和鑒定實驗用具
洋蔥或其他植物、洗潔精、食鹽、攪拌機或研缽(我們采用的是家用豆?jié){機)、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、試管(20mL兩支)、天平。95%酒精、蒸餾水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑。
實驗材料的選取
凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。
原理
①加入蒸餾水能使雞血細胞破裂
蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。
②加入洗滌劑和食鹽的作用
洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放;食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
③研磨不充分，對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響
研磨不充分會使細胞核內(nèi)的.DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。
④此步驟獲得的濾液中可能含有的細胞成分?
可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。
實驗步驟
1.破碎細胞，獲取含DNA的濾液
動物細胞的破碎比較容易，以雞血細胞為例，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實驗材料是植物細胞，需要先用洗滌劑溶解細胞膜。例如，提取洋
.
蔥的DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。
2. 去除濾液中的雜質(zhì)
方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。
注意事項
①用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。
②方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開;方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。
DNA的析出與鑒定
將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。
取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑�；旌暇鶆蚝�，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍。
實驗步驟
1.稱取30克已切碎的洋蔥，放入研缽中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化鈉溶液，充分研磨。
洋蔥含有揮發(fā)性刺激物，有效減少刺激，才能使實驗順利進行。上課前，教師可先將洋蔥放入冰箱冷凍一會兒，使其涼透但又不能結(jié)冰;或?qū)⒀笫[切成幾大塊，放入清水泡一會兒，讓其揮發(fā)性刺激物溶于水，可以減輕刺激。然后將洋蔥切碎備用。研磨的目的主要是使洋蔥細胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化鈉溶液，沒必要將洋蔥研成粥糊狀，后者既浪費時間又影響實驗效果。研磨時，切忌使用攪拌器(榨汁機)。使用攪拌器雖可以提高研磨效率，但攪拌器將洋蔥切成極細小的顆粒，無法通過過濾將洋蔥顆粒剔除。只能將酒精直接倒入濾液中，許多洋蔥小顆粒因為輕會漂浮起來，DNA藏在其中，無法分辨。學(xué)生看不到白色纖維狀粘稠物的DNA。
2.研磨后，用漏斗和紗布將汁液過濾到小燒杯中，得到濾液。
3.向濾液中加入95%的酒精溶液20mL，沿?zé)诰従彽谷�，不要震動或攪拌�?/p>
此時，燒杯中的液體分為上、下兩層，下層較渾濁，上層澄清，很快上層溶液中就會有白色纖維狀粘稠物析出，用玻璃棒可將其輕輕卷起。這就是記錄生命遺傳信息的重要物質(zhì)——DNA。DNA析出的過程中，切忌震動和攪拌(不震動易于分層，我們就能很容易觀察到上清液中的絲狀物;攪拌會使非常柔軟的DNA斷裂成小段，不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙簽，DNA提取物就纏繞在牙簽上了。
4.鑒定：取兩支試管，編為1、2號，各加入2mol/L的氯化鈉溶液2mL，向1號試管中加入一些白色纖維狀物，振蕩使其溶解，然后向兩支試管中各加入2mL二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘。
注意事項
1.以血液為實驗材料時，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。
2.加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
3.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。
4.DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：
當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低;當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。
5.盛放雞血細胞液的容器，最好是塑料容器。
雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細胞內(nèi)DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會更少。因此，實驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。
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