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dna粗提取與鑒定
大家知道dma嗎？下面我們來(lái)做一個(gè)實(shí)驗(yàn)，了解實(shí)驗(yàn)原理，學(xué)會(huì)DNA的粗提取和鑒定的方法，觀察提取出來(lái)的DNA物質(zhì)。下面小編為您帶來(lái)dna粗提取與鑒定！
dna粗提取與鑒定
實(shí)驗(yàn)原理
DNA在氯化鈉溶液中的溶解度，是隨著氧化鈉的濃度的變化而改變的。當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L時(shí)，DNA的溶解度最大，濃度為0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中的DNA析出。
DNA不溶于95%的酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。
DNA中含有脫氧核糖，能與二苯胺(沸水浴)反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。
目的要求
1.學(xué)會(huì)DNA的粗提取和鑒定的方法。
2.觀察提取出來(lái)的DNA物質(zhì)的顏色和形狀。
材料用具
材料：活雞或鮮血雞血。
儀器：離心機(jī)、恒溫水裕鍋、載玻片，玻璃棒，濾紙，滴管，量簡(jiǎn)(100mL，l個(gè))，燒杯(100mL，l個(gè)，50mL、500mL各2個(gè))，試管(20mL，2個(gè))，漏斗，試管夾，紗布。
試劑：酒精的體積分?jǐn)?shù)為95%的溶液(實(shí)驗(yàn)前置于冰箱內(nèi)冷卻24h)，蒸餾水，檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為0.1g/mL的溶液，氯化鈉的物質(zhì)的量濃度分別為2mol/L和0.015mol/L的溶液，二苯胺試劑。
方法步驟
實(shí)驗(yàn)前需要制備雞血細(xì)胞液(由教師完成)，制備的方法是：取檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為0.1g/mL的溶液(抗凝劑)100mL，置于500mL燒杯中。將宰殺活雞流出的雞血(約180mL)注入燒杯中，同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免凝血。然后，將血液倒入離心管內(nèi)，用1000r/min的離心機(jī)離。2min，此時(shí)血細(xì)胞沉淀于離心管底部。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用吸管除去離。心管上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。
1.提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)
將制備好的雞血細(xì)胞液5mL～10mL，注入到50mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20mL，同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢?min，使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過(guò)濾至500mL。取其濾液。
2.溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA
將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol的溶液40mL加入到濾液中，并搖動(dòng)燒杯，使其混合均勻，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)。
3.析出含DNA的粘稠物
沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來(lái)越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸餾水(這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14mol/L)。
4.濾取含DNA的粘稠物
用放有多層紗布的漏斗，過(guò)濾步驟3中的溶液至500mL的燒杯中，含DNA的粘稠物被留在紗布上。
5.將DNA的粘稠物再溶解
取1個(gè)50mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L的溶液20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地?cái)嚢瑁拐吵砦锉M可能多地溶解于溶液中。
6.過(guò)濾含有DNA的氯化鈉溶液
取1個(gè)100mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中。
7.提取含雜質(zhì)較少的DNA
在上述濾過(guò)的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為95%的溶液50mL(使用冷卻的酒精，對(duì)DNA的凝集效果較佳)，并用玻璃棒攪拌，溶液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA。注意觀察絲狀物是什么顏色的。
8.DNA的鑒定
取兩支20mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0.015mol/L的溶液5mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑�；旌暇鶆蚝�，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化。將觀察的結(jié)果填寫在《實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊(cè)》上。
結(jié)論
步驟8的2支試管中溶液顏色的變化說(shuō)明了什么？將得出的結(jié)論填寫在《實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊(cè)》上。
討論
1.提取雞血中的DNA時(shí)，為什么要除去血液中的上清液？
2.步驟回和步驟3中都需要加入蒸餾水，兩次加入的作用相同嗎？為什么？
3.DNA的直徑約為20×10-10m，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的絲狀物的粗細(xì)是否表示1個(gè)DNA分子直徑的大�。�
dna粗提取與鑒定
【復(fù)習(xí)目標(biāo)】
本課題通過(guò)嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取，了解DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取以及DNA鑒定的原理。
【復(fù)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)】
復(fù)習(xí)重點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。
復(fù)習(xí)難點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。
【知識(shí)回顧】
一、實(shí)驗(yàn)原理
提取生物大分子的基本思路是選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。對(duì)于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
1．DNA的溶解性
DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。
此外，DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。
2．DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性
蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60—80oC的高溫，而DNA在80oC以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。
3．DNA的鑒定
在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1．實(shí)驗(yàn)材料的選取
凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。
2．破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液
動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液。
注意：
�、贋槭裁醇尤胝麴s水能使雞血細(xì)胞破裂？
蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。
�、诩尤胂礈靹┖褪雏}的作用分別是什么？
洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
�、廴绻心ゲ怀浞郑瑫�(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？
研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。
�、艽瞬襟E獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？
可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。
2．去除濾液中的雜質(zhì)
方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA；方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。
注意：
�、贋槭裁捶磸�(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？
用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。
�、诜桨付c方案三的原理有什么不同？
方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。
3．DNA的析出與鑒定
將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。
取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍(lán)。
三、實(shí)驗(yàn)步驟—以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料
1．稱取30克已切碎的洋蔥，放入研缽中，加入少量石英砂助研，倒入10mL2mol/L的氯化鈉溶液，充分研磨。
洋蔥含有揮發(fā)性刺激物，有效減少刺激，才能使實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。上課前，教師可先將洋蔥放入冰箱冷凍一會(huì)兒，使其涼透但又不能結(jié)冰；或?qū)⒀笫[切成幾大塊，放入清水泡一會(huì)兒，讓其揮發(fā)性刺激物溶于水，可以減輕刺激。然后將洋蔥切碎備用。研磨的目的主要是使洋蔥細(xì)胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化鈉溶液，沒(méi)必要將洋蔥研成粥糊狀，后者既浪費(fèi)時(shí)間又影響實(shí)驗(yàn)效果。研磨時(shí)，切忌使用攪拌器（榨汁機(jī)）。使用攪拌器雖可以提高研磨效率，但攪拌器將洋蔥切成極細(xì)小的顆粒，無(wú)法通過(guò)過(guò)濾將洋蔥顆粒剔除。只能將酒精直接倒入濾液中，許多洋蔥小顆粒因?yàn)檩p會(huì)漂浮起來(lái)，DNA藏在其中，無(wú)法分辨。學(xué)生看不到白色纖維狀粘稠物的DNA。
2．研磨后，用漏斗和紗布將汁液過(guò)濾到小燒杯中，得到濾液。
3．向?yàn)V液中加入95%的酒精溶液20mL，沿?zé)诰従彽谷�，不要震�?dòng)或攪拌。
此時(shí)，燒杯中的液體分為上、下兩層，下層較渾濁，上層澄清，很快上層溶液中就會(huì)有白色纖維狀粘稠物析出，用玻璃棒可將其輕輕卷起。這就是記錄生命遺傳信息的重要物質(zhì)——DNA。DNA析出的過(guò)程中，切忌震動(dòng)和攪拌（不震動(dòng)易于分層，我們就能很容易觀察到上清液中的絲狀物；攪拌會(huì)使非常柔軟的DNA斷裂成小段，不易取出）。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙簽，DNA提取物就纏繞在牙簽上了。
4．鑒定：取兩支試管，編為1、2號(hào)，各加入2mol/L的氯化鈉溶液2mL，向1號(hào)試管中加入一些白色纖維狀物，振蕩使其溶解，然后向兩支試管中各加入2mL二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘。
四、注意事項(xiàng)
1．以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。
2．加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
3．二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。
4．DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：
當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。
5．盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。
雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過(guò)程的DNA的損失。
dna粗提取與鑒定
目的要求
1.了解實(shí)驗(yàn)原理。
2.學(xué)會(huì)DNA的粗提取和鑒定的方法，觀察提取出來(lái)的DNA物質(zhì)。
3.通過(guò)本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作能力和觀察能力。
實(shí)驗(yàn)原理
1.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。
當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14mol／L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA.
3.DNA遇二苯胺（沸水�。⿻�(huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。
注意事項(xiàng)
1.步驟3析出含DNA的黏稠物中，蒸餾水要沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入，不能一次快速倒入。
2.實(shí)驗(yàn)中有多個(gè)步驟都要用玻璃棒進(jìn)行攪拌，但是在不同的步驟中玻璃棒的用法不同。
實(shí)驗(yàn)用具
雞血細(xì)胞液（5～10mL）；體積分?jǐn)?shù)為95％的冷酒精，蒸餾水，質(zhì)量濃度為0.1g／mL的檸檬酸鈉溶液，物質(zhì)的量濃度分別為2mol／L和0.015mol／L的NaCl溶液，二苯胺試劑；燒杯（100mL，1個(gè)，50mL，500mL，各2個(gè)），漏斗，試管（20mL，2個(gè)），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1個(gè)），紗布，鑷子，濾紙，鐵架臺(tái)，鐵環(huán)，三角架，酒精燈，石棉網(wǎng)，載玻片，試管夾。
課前準(zhǔn)備
制備雞血細(xì)胞液，方法是：將質(zhì)量濃度為0.1g／mL的檸檬酸鈉溶液100mL，置于500mL燒懷中，注入新鮮的雞血（約180mL），用玻璃棒攪拌，使其充分混合，以免凝血。靜置于冰箱內(nèi)一天，使血細(xì)胞自行沉淀。（也可以用離心機(jī)離心2min（轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)/分）。用吸管吸去上清液。
板書：（課前寫好）
實(shí)驗(yàn)十一DNA的粗提取與鑒定
實(shí)驗(yàn)原理：
1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA.
2.用冷酒精提取出含雜質(zhì)較少的DNA.
3.DNA在沸水浴時(shí)被二苯胺染成藍(lán)色。
方法步驟：
1.提取細(xì)胞核物質(zhì)：順時(shí)針?lè)较驍嚢�，稍快，稍重�?min
2.溶解DNA：
3.析出含DNA的黏稠物：蒸餾水300mL，逆時(shí)針?lè)较驍嚢�，緩�?/p>
4.過(guò)濾：取黏稠物
5.再溶解：順時(shí)針?lè)较驍嚢瑁^慢。3min
6.過(guò)濾：取濾液。
7.提取出含雜質(zhì)較少的DNA，逆時(shí)針?lè)较驍嚢瑁月?min
8.DNA的鑒定：沸水浴5min
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