氨基酸分析法對(duì)蛋白定量的初步分析論文
近年來(lái)，生物技術(shù)藥物發(fā)展迅速，在疾病的預(yù)防、診斷及治療中發(fā)揮著重要作用，而重組蛋白類藥物在生物技術(shù)藥物中占有較大比重。蛋白質(zhì)含量測(cè)定是重組蛋白類藥物質(zhì)量控制中的重要指標(biāo)之一，準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)含量測(cè)定對(duì)產(chǎn)品的分裝、比活性計(jì)算、殘留雜質(zhì)的限量控制以及其他理化特性測(cè)定均具有重要意義。而蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品作為蛋白含量測(cè)定中的“標(biāo)準(zhǔn)”或“尺子”，其本身的準(zhǔn)確定量十分重要。
現(xiàn)行的蛋白含量測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品用于Lowry法或其他方法測(cè)定蛋白含量，其按《中國(guó)藥典》三部(2010版)、WHO、ICH標(biāo)準(zhǔn)品有關(guān)要求進(jìn)行制備、分裝、凍干、質(zhì)量檢測(cè)，并開(kāi)展了協(xié)作標(biāo)定。該標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)檢定，分裝精度(分裝誤差<1%)、外觀、無(wú)菌、水分(0.7%)均符合要求，并經(jīng)多家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行凱氏定氮協(xié)作標(biāo)定，結(jié)果為19.83mg/支。氨基酸分析是通過(guò)強(qiáng)酸或強(qiáng)堿破壞蛋白質(zhì)中的肽鍵，進(jìn)而使蛋白質(zhì)水解為氨基酸的過(guò)程。再通過(guò)對(duì)組成蛋白質(zhì)的各個(gè)氨基酸的分析進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的組成或定量分析。國(guó)外已有實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用氨基酸分析的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量，本實(shí)驗(yàn)旨在利用氨基酸分析的方法對(duì)蛋白含量測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，并與凱氏定氮的結(jié)果進(jìn)行比較，以探討氨基酸分析的方法用于該標(biāo)準(zhǔn)品或直接對(duì)其他重組蛋白定量的可行性。
1材料與方法
1.1標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：(2005)國(guó)生標(biāo)字0009，為本室保存。
1.2主要試劑及儀器17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)自日本Ajinomoto公司;其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;L8800型氨基酸分析儀購(gòu)自日本Hitachi公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)為RE-52AA)購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠。
1.3氨基酸組成分析
1.3.117種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml，用0.02mol/L的鹽酸稀釋，容量瓶定容至50ml。將配制好的溶液作為樣品氨基酸組成分析的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在進(jìn)樣的20μl中含脯氨酸4nmol，其他16種氨基酸2nmol。
1.3.2系統(tǒng)的適用性驗(yàn)證色譜條件：用L8800型氨基酸組成分析儀進(jìn)行分析，交換柱為46mm×60mm，填料為3m的磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂;柱溫：57℃，反應(yīng)器溫度：135℃，檸檬酸鈉緩沖液梯度洗脫，流速：0.4ml/min。各流動(dòng)相的配制及洗脫程序均按照氨基酸分析的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。取上述配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每針進(jìn)樣20μl，連續(xù)進(jìn)樣3針，計(jì)算各組分峰面積及保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation，RSD)，考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
1.3.3蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品最佳水解時(shí)間的考察分別精密稱取蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品5.4、5.1、5.7、5.7mg，加入氨基酸水解管中，加入6mol/L的鹽酸溶液5ml，充氮，密封。在110℃條件下分別水解16、20、24、28h。水解后的樣品全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸，干燥后的樣品精確加入5ml水溶解，過(guò)0.45μm濾膜后上機(jī)備用。按照1.3.2項(xiàng)方法進(jìn)行氨基酸組成分析，并計(jì)算回收率，考察蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的最佳水解時(shí)間。
1.3.4蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的氨基酸組成分析取蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品7支，從每一支標(biāo)準(zhǔn)品中精密量取人血白蛋白(humanserumalbumin，HSA)約5mg，分別加入氨基酸水解管中，加入6mol/L的'鹽酸溶液5ml，充氮，密封。在110℃條件下，按照1.3.3項(xiàng)中確定的最佳水解時(shí)間進(jìn)行水解。水解后的樣品全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸。干燥后的樣品精確加入5ml水溶解，過(guò)0.45μm濾膜后上機(jī)備用。按照1.3.2項(xiàng)方法進(jìn)行氨基酸組成分析，樣品每針進(jìn)樣10μl。并計(jì)算RSD、變異系數(shù)(CV)及回收率，驗(yàn)證方法的精密性及準(zhǔn)確性。
1.3.5數(shù)據(jù)處理將機(jī)器自動(dòng)分析得到的各氨基酸含量(即10μl樣品中含有的ng數(shù))按照樣品濃度轉(zhuǎn)化為100mg樣品中的mg數(shù)(如精密稱量的樣品質(zhì)量為5.1mg，干燥后精確加入5ml水溶解，則樣品濃度為：5.1mg/5ml=102mg/100ml，氨基酸分析測(cè)得的天門(mén)冬氨酸為939.64ng/10μl，則樣品中天門(mén)冬氨酸含量為8.70mg/100mg)。通過(guò)對(duì)7支樣品的測(cè)定，得到每種氨基酸測(cè)得結(jié)果的平均值，對(duì)測(cè)得的17種氨基酸的量進(jìn)行加和，即可算出100mg樣品中測(cè)得的樣品mg數(shù)，進(jìn)而計(jì)算出氨基酸分析儀測(cè)得的蛋白含量為實(shí)際稱量的蛋白含量的百分?jǐn)?shù)。另取蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品5支，按《中國(guó)藥典》三部(2010版)“裝量差異”法要求，計(jì)算其平均裝量，與上述氨基酸分析得到的百分?jǐn)?shù)相乘，即為蛋白含量值。
2結(jié)果
2.1系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)進(jìn)樣3針系統(tǒng)對(duì)各氨基酸組分均有良好的分離，其中各組分峰面積的RSD均小于1.5%，保留時(shí)間的RSD均小于1%，Thr-Ser、Gly-Ala和Ile-Leu均得到較好的分離，見(jiàn)圖1。表明色譜分離條件合適，系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，可滿足分析的需要。
2.2蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的最佳水解時(shí)間由于蛋白質(zhì)樣品在酸水解過(guò)程中會(huì)不同程度地造成氨基酸的水解破壞，理論上推測(cè)該方法測(cè)得的蛋白含量應(yīng)小于實(shí)際稱量的蛋白量，因此，排除與100%最為接近的20h水解樣品得到的102.75%，選擇結(jié)果為96.55%的水解樣品的水解時(shí)間24h。
2.3蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的氨基酸組成分析經(jīng)計(jì)算，蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品樣品的含量值為(95.02±3.99)mg/100mg，RSD為4.20%。7次測(cè)定中，各氨基酸含量測(cè)定值的CV均小于1%。標(biāo)準(zhǔn)品中各氨基酸的回收率在93.56%～105.12%之間。5支蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品平均裝量為0.0216g，即21.6mg，推算出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品中白蛋白含量為20.52mg，與現(xiàn)行的凱氏定氮標(biāo)定值(19.83mg)相比偏高，為其測(cè)定值的103.48%。
3討論
質(zhì)量控制的重要原則之一是能夠進(jìn)行量值溯源，標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確定量是其中最重要的環(huán)節(jié)。本研究中蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的原料為HSA，是通過(guò)對(duì)健康人血漿采用低溫乙醇蛋白分離法或其他方法制備的，在制成標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，僅添加了磷酸鹽，因此其適合進(jìn)行氨基酸分析，而無(wú)干擾。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，采用稱重法將氨基酸分析法測(cè)得的蛋白含量值最終溯源到砝碼上，主要是由于該標(biāo)準(zhǔn)品為白蛋白純品，添加的微量磷酸鹽可忽略不計(jì)，稱量所得質(zhì)量與實(shí)際質(zhì)量應(yīng)相符，實(shí)際稱量值可對(duì)測(cè)得值進(jìn)行驗(yàn)證，保證了測(cè)得結(jié)果的準(zhǔn)確性。
對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸分析，首先要將其肽鍵斷裂(水解)形成游離氨基酸。水解過(guò)程中，Asn變成Asp，Gln變成Glu。本實(shí)驗(yàn)采用的是氨基酸分析儀，其原理是茚三酮柱后衍生法，即水解后的游離氨基酸經(jīng)陽(yáng)離子交換色譜柱分離后，與茚三酮反應(yīng)，其中Pro與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色產(chǎn)物，在440nm處檢測(cè)該產(chǎn)物，其他氨基酸與茚三酮反應(yīng)則生成藍(lán)紫色產(chǎn)物，在570nm處進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分離得到的各氨基酸的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品中對(duì)應(yīng)氨基酸峰面積進(jìn)行比較，實(shí)現(xiàn)對(duì)各氨基酸的定量。在實(shí)際應(yīng)用中，也可應(yīng)用特定的試劑盒，結(jié)合高效液相色譜法進(jìn)行氨基酸分析，避免了專一設(shè)備昂貴，不易于推廣的缺點(diǎn)。氨基酸分析進(jìn)行蛋白質(zhì)定量具有以下優(yōu)勢(shì)：首先，凱氏定氮樣品需求量較大，在一定程度上限制了該方法的應(yīng)用，而氨基酸分析的方法自動(dòng)化程度高，重復(fù)性好，所需樣品量少，對(duì)于較難獲得或樣品量不大的標(biāo)準(zhǔn)品適于用氨基酸分析法定量;其次，目前廣泛采用的Lowry、BCA、Bradford等方法均是與蛋白中的特定氨基酸或特定基團(tuán)反應(yīng)，各種蛋白其氨基酸組成不同，必定對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。另外，標(biāo)準(zhǔn)品不同質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生誤差，而氨基酸分析是對(duì)不同蛋白的個(gè)性化分析，可避免上述缺點(diǎn);再次，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，新的、復(fù)雜蛋白不斷出現(xiàn)，糖基化、PEG化引起的蛋白結(jié)構(gòu)變化使原有的含量測(cè)定方法不適用，而氨基酸分析不受結(jié)構(gòu)的影響，具有一定的優(yōu)勢(shì)。
本研究將氨基酸分析法得到的定量值與凱氏定氮值進(jìn)行比較，以考察氨基酸分析定量方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，兩者無(wú)明顯差異，初步表明本研究所采用的氨基酸分析方法對(duì)現(xiàn)行蛋白含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白含量測(cè)定準(zhǔn)確，但還需進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。
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