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談白芍提取物對經(jīng)前期綜合征肝氣郁證模型論文
白芍性微寒，味苦酸。歸肝、脾經(jīng)。功能養(yǎng)肝血，補(bǔ)肝陰，抑肝陽，為促進(jìn)肝主疏泄調(diào)暢情志活動的重要中藥之一�，F(xiàn)代中醫(yī)藥研究中，常用白芍來治療抑郁癥，無論在組方頻次和用藥劑量上，白芍都占有重要地位。本實(shí)驗室也已通過曠場實(shí)驗和糖水偏好實(shí)驗等行為學(xué)指標(biāo)證實(shí)白芍提取物能夠改善PMS 肝氣郁證模型大鼠的抑郁樣行為(尚未發(fā)表)，并且對以白芍提取物作為君藥的舒郁膠囊在5-HT3R 水平干預(yù)肝氣郁證及PMS 肝氣郁證的作用機(jī)制也有諸多研究[2,3]。本文以PMS 肝氣郁證為動物模型，用白芍提取物進(jìn)行藥物干預(yù)，旨在探討白芍提取物在5-HT3R 水平改善抑郁樣行為的作用機(jī)制。
1 材料
1.1 動物
健康雌性Wistar 大鼠，180-200 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，許可證號: SCXK(魯)2011-0003。
1.2 藥品與試劑
白芍提取物(青島陽光海川醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，含芍藥總苷35%)。兔抗大鼠5-HT3AR 多克隆抗體(Abcam，ab51950)，5-HT3A 二抗(Abcam，ab-16248);羊抗大鼠5-HT3BR 多克隆抗體(SantaCruz，sc-51198)，Anti-HTR3B(MFG40388)，驢抗山羊5-HT3B 二抗IgG-HRP(Santa Cruz，sc-2020);β-actin一抗(Sigma，A1978)，β-actin 二抗(Santa Cruz，sc-2005)。碧云天cy3 標(biāo)記驢抗山羊IgG(H+L)(AO505)，Alexa Fluor 488 標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(AO423)。
1.3 儀器
主要儀器有：共聚焦顯微鏡ZEISS LSM710;切片機(jī)(Thermo Scientific Microm HM 340E);電泳儀、蛋白印跡轉(zhuǎn)移裝置(SDS-PAGE，美國伯樂公司);硝酸纖維素(NC)膜(美國PALL 公司，批號：T03157)。
2 方法
2.1 PMS 肝氣郁證大鼠模型復(fù)制及給藥
利用慢性束縛應(yīng)激法制備模型，將篩選合格的大鼠分為3 組， 每組12 只，即正常組對照組(Normal)、PMS 肝氣郁證模型組(Model)和白芍提取物組(Paeoniae alba extract)。除正常對照組外各組共接受5 天的慢性束縛應(yīng)激刺激，期間每天給予白芍提取物36 mg·kg-1(相當(dāng)于芍藥總苷12.6mg·kg-1)，相當(dāng)于臨床成人的8 倍劑量;正常組和造模組均給予等量生理鹽水。
2.2 腦組織取材
將各組大鼠(每組6 只)，斷頭處死，于冰塊上迅速剝離額葉，放置于-80℃冰箱western blot 實(shí)驗備用;另外每組6 只大鼠用戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)麻醉后，固定于鼠板上，打開胸腔，先用生理鹽水速灌沖洗血液，再用固定液(4% 多聚甲醛-0.1 mol·L-1PBS pH 7.4)進(jìn)行心臟灌流。至大鼠身體僵直后，迅速剝離鼠腦，切取所需的額葉，置于上述固定液中，4℃保存過夜，常規(guī)洗滌脫水，石蠟包被，切片后用于免疫熒光雙標(biāo)記實(shí)驗。
2.3 免疫熒光技術(shù)檢測大鼠額葉5-HT3AR、5-HT3BR分布
將石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟，用微波爐進(jìn)行抗原熱修復(fù)，純水沖洗后滴加正常山羊血清室溫封閉 60min;滴加一抗稀釋液(1?400)，4℃ 過夜。PBS洗滌，滴加熒光二抗混合液(1?500)，室溫避光孵育 2 h，PBS 充分洗去未與一抗結(jié)合的熒光二抗及未與核結(jié)合的DAPI。洗滌完畢后，擦干載玻片組織周圍水分，在組織旁滴加兩滴甘油，蓋玻片封片后，可分別置于低倍激光共聚焦顯微鏡(10×10)和高倍顯微鏡(10×40)下觀察5-HT3AR、5-HT3BR 在額葉的分布狀態(tài)及同位點(diǎn)表達(dá)情況并拍照。
2.4 Western blot 檢測大鼠前額皮層5-HT3AR、5-HT3BR 蛋白表達(dá)
2.4.1 蛋白提取及定量
從-80℃冰箱取出保存的額葉，冰浴中操作，按1?100 的比例(mg·μL-1)加入提前預(yù)冷的 RIPA 裂解液，用勻漿器勻漿30 s，4℃離心機(jī)12 000 r·min-1離心15 min，吸取10 μL 上清液，用Bradford 法測定蛋白含量;按 4?1 在上清液中加入 5×SDS 上樣緩沖液，置于沸水浴中5 min 使蛋白變性，再用離心機(jī)12 000 r·min-1 離心5 min，取上清液，分裝，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2.4.2 Western blot 測定額葉5-HT3AR、5-HT3BR 表達(dá)
以45 μg 額葉總蛋白每泳道上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)移至NC 膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBST 溶液室溫封閉2 h，分別與相應(yīng)的一抗(Anti-5-HT3B，1?400;Anti-5-HT3A，1:400)和 β-actin 一抗(1?1 500)室溫?fù)u床孵育 4℃過夜，TBST洗膜3 次，每次5 min，再加入各自相應(yīng)的二抗(Anti-5-HT3A，1?400;Anti-5-HT3B，1?400)，室溫孵育2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次50 min，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑檢測雜交信號，顯影于X 線片上，用凝膠成像分析儀在可見光透射下對X 線片進(jìn)行掃描和圖像分析。5-HT3AR 和5-HT3BR 與內(nèi)參β-actin 做灰度比值，以此作為所測樣品中相應(yīng)指標(biāo)的相對表達(dá)量。
3 結(jié)果
3.1 各組大鼠額葉5-HT3AR 和5-HT3BR 的表達(dá)情況
各組大鼠額葉5- HT3AR 和5- HT3BR 陽性細(xì)胞分別呈紅色、綠色熒光，二者共表達(dá)呈黃色，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，分布模式無明顯差別，額區(qū)陽性細(xì)胞分布都比較均勻，多分布于細(xì)胞膜，細(xì)胞形態(tài)多為點(diǎn)狀或圓形。
3.2 額葉5-HT3AR 蛋白表達(dá)結(jié)果
以β-actin 為內(nèi)參，5-HT3AR 蛋白表達(dá)量的光密度掃描顯示見圖2，與正常對照組相比，PMS肝氣郁證模型組5-HT3AR 蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與PMS 肝氣郁證模型組相比，白芍提取物給藥組5-HT3AR 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，且趨于正常水平。
3.3 額葉5-HT3BR 蛋白表達(dá)結(jié)果
以β-actin 為內(nèi)參，5-HT3BR 蛋白表達(dá)量的光密度掃描顯示見圖2，與正常對照組相比，PMS 肝氣郁證模型組5-HT3BR 蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與PMS 肝氣郁證模型組相比，白芍提取物給藥組5-HT3BR 蛋白表達(dá)水平有下降趨勢但無統(tǒng)計學(xué)差異。
4 討論
中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT3R 亞型參與抑郁、焦慮、藥物戒斷癥狀等病理過程。前期研究也證明抑郁證模型大鼠及郁怒情緒模型大鼠異常情緒的發(fā)生跟海馬及下丘腦5-HT3BR 蛋白水平異常升高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PMS 肝氣郁證模型額葉5-HT3AR、5-HT3BR蛋白表達(dá)明顯增加，證實(shí)了該受體與PMS 肝氣郁證抑郁情緒密切相關(guān)，這與本實(shí)驗室前期研究抑郁情緒模型大鼠血清培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元5-HT3AR、5-HT3BR 蛋白表達(dá)異常升高相吻合，由此推測PMS 肝氣郁證在5-HT3R 水平的發(fā)病機(jī)制可能與5-HT3AR、5-HT3BR 蛋白表達(dá)水平異常有關(guān)。5-HT3AR 為功能性受體，5-HT3R 其它亞基均不能形成單獨(dú)功能性受體，至少需要A 亞基共表達(dá)才能形成功能性作用。本實(shí)驗實(shí)驗結(jié)果顯示白芍提取物能下調(diào)PMS 肝氣郁證抑郁情緒導(dǎo)致異常升高的5-HT3AR 蛋白表達(dá)，而對5-HT3BR 蛋白表達(dá)的異常增加無明顯逆轉(zhuǎn)，這可能與5-HT3AR 表達(dá)廣泛，而5-HT3BR 表達(dá)則相對較低有關(guān)系。現(xiàn)代研究顯示芍藥總苷能通過調(diào)控5-HT 能系統(tǒng)發(fā)揮其抗抑郁樣行為的作用5-HT3R拮抗劑有抗抑郁樣作用。
本實(shí)驗白芍提取物能下調(diào)則PMS 肝氣郁證抑郁情緒模型大鼠5-HT3AR 蛋白表達(dá)異常增加，可以推測白芍提取物可能直接發(fā)揮了5-HT3R 拮抗劑的作用。又有研究表明5-HT3R 拮抗劑可以加強(qiáng)5-HT再攝取抑制劑的抗抑郁作用。由此可以推測，白芍提取物也可能是通過改變其他內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)的含量或結(jié)合活性，繼而影響了5-HT3AR 的蛋白表達(dá)，從而間接發(fā)揮了白芍提取物的抗抑郁樣行為作用。有研究表明芍藥苷的抗抑郁作用通過發(fā)揮鈉離子、鈣離子和鉀離子拮抗劑的功能來實(shí)現(xiàn)，而5-HT3R 通道激活后為非選擇性陽離子通道，即對鈉離子、鉀離子和鈣離子均可通透，但其對鈣離子的通透性隨亞基種類不同而異。由此可見，為進(jìn)一步探索白芍提取物抗抑郁情緒的作用機(jī)制，不僅要探討5-HT3R 亞型的蛋白表達(dá)變化，還要繼續(xù)研究白芍提取物發(fā)揮其抗抑郁情緒的作用與5-HT3R 通道電流的關(guān)系。
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