植物抗污染分化進化研究進展及其分子生物學技術的應用理工論文
長期以來人們憑借形態(tài)特征和數(shù)量變化來進行植物抗污染生態(tài)分化研究，但對許多深入的研究卻無能為力。目前，分子生物學技術日趨成熟并已大量運用于污染進化生態(tài)學研究中。這些技術的引入為傳統(tǒng)分化進化研究打開了新局面，為進一步從本質上揭示污染條件下植物進化提供了可能。只有將分子生物學技術引入植物抗性進化研究中，將宏觀與微觀結合起來我們才有可能使許多問題得以解決[19]。同工酶、等位酶電泳技術的完善，作為第一代分子生物學標記的RFLP技術，以及近年來PCR技術的成熟和RAPD技術在國內外迅速發(fā)展，為實現(xiàn)上述研究提供了迅捷可靠的工具。
2.1同工酶電泳技術
同工酶作為基因產物的蛋白質，其結構的多樣性在一定程度上反映出不同種群在不同污染歷史條件下分化進化上DNA組成和生物體遺傳多樣性。同工酶之所以作為分化進化的重要研究對象，首先是因為它在品種間有豐富的多樣性。目前一半以上的酶類存在同工酶類。其次，同工酶易于檢測出。同工酶雖然由單拷貝基因編碼，但通過酶染色放大作用同樣易于檢測出。
等位酶作為一種特殊形式的同工酶，它由一個基因位點、不同等位基因編碼。根據等位酶譜帶的遺傳分析確定出每種等位基因在居群中的頻率，從而計算出它們的遺傳相似度或遺傳距離，再根據遺傳距離分析植物對污染的適應過程中遺傳結構變化，依據分子鐘進化理論計算出遺傳進化的理論時間，從而評估污染對植物進化影響的速度和強度[8、14]。目前的研究結果表明，經歷污染時間越長，居群間的遺傳相似系數(shù)就越小[5,14,21]
Mejnartowicz[24]利用同工酶技術發(fā)現(xiàn)受氟化物、SO2污染的蘇格蘭松F1代某些基因和基因型大為減少，Muller-Starck等[22]利用同工酶技術研究表明歐洲山毛櫸同工酶平均每個位點基因數(shù)目隨污染而下降，Scholz等[23]檢測了挪威云杉對SO2敏感性各不相同的一系列無性系的若干同工酶位點，也證明一定量的遺傳信息有因污染而喪失的危險性[20-22]。但是，由于種群雜合性影響，某些同工酶分析顯示了相互矛盾的結果，這表明同工酶技術所揭示的與污染脅迫的植物遺傳變異的復雜性[3、15、21、25]。
2.2RFLP技術
RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisma,限制性內切酶片段長度多態(tài)性)作為第一代分子生物學標記自問世以來已廣泛運用于多門生物學科研究中，但它運用于植物抗性研究還只是近幾年的事。RFLP能對植物的.抗性基因進行定位和分離，利用RFLP技術，對于核基因組或葉綠體基因組、尤其是后者，若能提取純凈DNA，則可直接從酶切后的電泳圖譜看出其多態(tài)性，利用這一方法可以測定種群內、種群間不同水平的物種在污染環(huán)境下抗性分化進化水平上的差異。
與核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中許多非常繁瑣工序，但相對RAPD而言，RFLP方法更費時、費力，需要進行DNA多種酶切、轉膜以及探針的制備等多個步驟，僅對基因組單拷貝序列進行鑒定。但RFLP又有比RAPD優(yōu)越之處，它可以用來測定多態(tài)性是由父本還是母本產生的，也可用來測定由多態(tài)性產生的突變類型究竟是由堿基突變或倒位、還是由缺失、插入造成的[26]。
2.3PCR技術
PCR(PloymeraseChainReactions,聚合酶鏈式反應)自80年代中期問世以來，以其快速、簡便、靈敏、特異等特點受到分子生物學界極大青睞，已廣泛用于基因工程、臨床檢驗、環(huán)境生物監(jiān)測以及進化生態(tài)學中核酸水平的基因多態(tài)性等研究領域。
PCR由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸三部反應構成一個擴增循環(huán)，使目的DN段得以迅速擴增。這一技術能選擇性富集一個特異DNA序列，并成106擴增。PCR擴增技術與RFLP結合使用其用途更為廣泛，PCR技術主要優(yōu)點有：①PCR與DNA測序結合，擴增后無需再克隆，純化即可直接測序。②可擴增一個只知基因一側或兩側堿基序列的基因。③可進行DNA多種突變的測定，如堿基互換、缺失、插入型突變[16]。PCR近幾年已逐漸引入到植物抗污染進化研究領域中，并表現(xiàn)出強大的應用潛力。
2.4RAPD技術
1990年Williams和Welsh等[27、28]運用隨機擴增尋找多態(tài)性DN段作為分子標記，并將此法命名為RAPD法(RandomAmplifiedPolymorphismDNA,隨機擴增多態(tài)性DNA)。盡管RAPD技術誕生時間不長，但由于其獨到的DNA多態(tài)性及快速和比PCR更簡便等特點，使它成為基因組遺傳圖譜構建；基因定位及進化生態(tài)學研究中最為重要手段之一。
RAPD與PCR、RFLP、DNA指紋圖技術相比，它有如下特點：①RAPD技術可在對受試物種缺乏任何分子生物學研究背景下，直接對基因組進行多態(tài)性分析。②操作簡單；一次RAPD擴增實際就是一次簡單的PCR反應，適合大量的樣本快速分析。③所需模板DNA量極少；一般一次擴增只需10-50ngDNA，這對于瀕危動植物的基因組分析是十分有效的[27、29-31]。④與RFLP相比，RAPD可免去探針克隆與分離過程，不需進行DNA序列分析。⑤RAPD同時適用于基因組的單拷貝區(qū)域或重復序列區(qū)。
RAPD在植物抗污染進化研究中具有重大推動作用。利用RAPD分析礦區(qū)不同重金屬污染歷史下作物DNA結構多樣性，從中可試圖找到對重金屬污染具有抗性的DN段或基因組。這些研究雖然在國內外剛剛起步，但這些工作直接從分子水平上分析污染條件下種群遺傳結構上的分化進化，在理論上具有廣闊的研究前景和意義。
2.5核酸序列測定
核酸序列測定包括DNA和RNA序列的測定。由于rRNA基因較保守，因此分子生物學中更重視rRNA基因的測定。在植物抗污染進化研究中主要運用葉綠體4.5SrRNA、5SrRNA及胞質5SrRNA基因，然而，核酸序列的測定在植物抗性分化進化研究中尚未見報導，此項技術在實際操作和運用上還有待于進一步完善。
3結語
近二三十年來分子生物學技術迅速成熟為植物抗污染進化研究提供了極為重要的研究工具和手段，為傳統(tǒng)的抗性研究打開了新的局面。同時，植物抗性進化研究為生態(tài)遺傳學、進化生態(tài)學以及作物選擇育種提供了背景材料和研究窗口。目前，分子生物學技術在抗性進化研究中的應用剛剛起步，有待于深入和發(fā)展。與此同時，我們也應清醒的認識到微觀技術研究有其自身的局限性，因此我們應站在宏觀進化生態(tài)學高度在理論、方向上進行指導，只有宏觀與微觀有機地結合起來，植物抗性進化研究才可能有更大的突破。
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