重組人PCNA突變體的克隆與穩(wěn)定表達

目的:構(gòu)建重組人PCNA突變體(mutant PCNA,mPCNA)的真核表達質(zhì)粒,并建立穩(wěn)定高表達該目的蛋白的宮頸癌細胞系Hela.為進一步研究PCNA在DNA損傷修復中重要的生物學功能奠定基礎.方法:將舍有定點突變的PCNA cDNA序列克隆到T載體中,然后再亞克隆到真核表達栽體pCDNA3.1/V5-His A上,構(gòu)建真核表達載體質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到Hela細胞中;Western Blotting法檢測蛋白的表達情況;白細胞記數(shù)法測定細胞的生長速率.結(jié)果:真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA經(jīng)酶切、測序分析與實驗設計的序列完全一致;穩(wěn)定建系后,Western Blotting結(jié)果顯示在相應位置可見清楚的目的條帶;穩(wěn)定高表達mPCNA的細胞系與野生型細胞相比兩者的生長速率基本一致.結(jié)論:成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA;建立了穩(wěn)定高表達該突變體的Hela細胞系;PCNA突變體的高表達不影響Hela細胞的正常生長.

作 者： 位全芳 楊勁 曾益軍 周虎傳 李勁 劉洋 李杰 WEI Quan-fang YANG Jin ZENG Yi-jun ZHOU Hu-chuan LI Jin LIU Yang LI Jie   作者單位： 位全芳,楊勁,曾益軍,周虎傳,WEI Quan-fang,YANG Jin,ZENG Yi-jun,ZHOU Hu-chuan(第三軍醫(yī)大學基礎部生化與分子生物學教研室,重慶,400038)

李勁,劉洋,李杰,LI Jin,LIU Yang,LI Jie(第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍泌尿外科研究所,重慶,400038) 

刊 名： 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展  ISTIC 英文刊名： PROGRESS IN MODERN BIOMEDICINE  年，卷(期)： 2008 8(4)  分類號： Q78 Q813  關鍵詞： 增殖細胞核抗原   突變體   穩(wěn)定轉(zhuǎn)染   Hela細胞  

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