超高壓水射流技術(shù)對葛根藥材化學(xué)成分影響研究

　　1、儀器與材料

　　LC-20AT高效液相色譜儀，包括LC-20AT泵、SPD-20A紫外檢測器、AT-330柱溫箱、Class-VP數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、7725i進樣閥（日本島津公司）；DPSB-3040型超高壓水射流系統(tǒng)（南京大地水刀股份有限公司）。

　　葛根為市售，經(jīng)本院王盛民教授鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata Ohwi的干燥根；葛根素對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200511）；甲醇為HPLC級（美國Fisher公司）；所用水為超純水；其余試劑均為分析純。

　　2、方法與結(jié)果

　　2.1 供試品溶液的制備稱取葛根藥材粗粉約500 g，精密稱定，10倍量80%的乙醇回流提取3次，2 h/次，合并提取液，過濾，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味，溶液定容至2 000 ml。量取葛根提取液200 ml，用超純水稀釋至20 L，分別在150，200，250，300和350 MPa壓力條件下，經(jīng)超高壓水射流處理，將各溶液搖勻、靜置，分別取未經(jīng)處理和各處理液的上清液過0.45 μm微孔濾膜，標(biāo)號為0，1，2，3，4，5號，作為供試品溶液。

　　2.2 對照品溶液的制備精密稱取葛根素對照品12.0 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每毫升含葛根素96 μg）。

　　2.3 葛根的薄層色譜鑒別照薄層色譜法實驗［2］，吸取“2.1”和“2.2”項制備的供試品溶液和對照品溶液各10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）為展開劑，展開，取出晾干，置日光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點。斑點較為圓整，分離效果好，各供試品斑點大小及Rf值無顯著差異。

　　2.4 HPLC色譜條件Symmetry?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（美國Waters）；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（25∶75）；檢測波長250 nm；流速1.0 ml·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μl。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)按葛根素峰計算不低于4 000，且樣品中葛根素與其他組分分離良好，對照品及樣品的色譜圖見圖1。

　　2.5 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2”項下制備的葛根素對照品溶液2，4，6，8，10 μl進樣測定，記錄各峰面積。以葛根素進樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，得回歸方程Y=704 877.60X-653.88，r=0.999 9。結(jié)果表明葛根素在0.192～0.960 μg濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

　　2.6 精密度實驗精密吸取葛根素對照品溶液10 μl，重復(fù)進樣5次，測定峰面積，得RSD為1.65%。穩(wěn)定性實驗取“2.1”項未經(jīng)超高壓水射流處理的供試品溶液，同法分別于2，4，6，8，24 h測定，進樣10 μl/次，結(jié)果RSD為1.37%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性實驗取同一批樣品粉末，按樣品含量測定法同法測定5次，RSD為2.38%，表明該測定方法重復(fù)性比較好。加樣回收實驗采用加樣回收法，稱取已知含量的葛根藥材5份，精密稱定，再分別精密加入葛根素對照品溶液 （0.20 mg·ml-1）20 ml，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣10 μl，記錄色譜圖，結(jié)果葛根素平均回收率為96.1%，RSD為1.14%（n=5）。

　　本文研究結(jié)果表明，不同壓力的水射流處理葛根醇提液后，處理液的溫度由進樣溫度19.8℃隨壓力的升高上升至51.8℃；葛根的薄層圖譜中斑點的個數(shù)、大小及Rf值無明顯差別；葛根的液相圖譜中峰的個數(shù)及形狀亦無明顯差別，作為葛根藥材的指標(biāo)性成分葛根素，其含量均符合藥典規(guī)定。經(jīng)過150，200，250，300 和350 MPa不同壓力水射流處理液中葛根素的含量都較原液升高，尤其以經(jīng)350 MPa壓力水射流處理液中葛根素含量最高，其原因可能是，由于葛根素本來就存在于葛根最外部的木栓層下的外部薄壁組織中，經(jīng)過超高壓水射流技術(shù)的瞬時卸壓、高速撞擊、高剪切和熱協(xié)同作用產(chǎn)生膨化效應(yīng)，破壞了藥材中微生物的細胞壁及細胞膜，同時引發(fā)對壓力敏感的非共價鍵（氫鍵、離子鍵、疏水鍵等）的破壞［5］，使得葛根素更容易浸出 。

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