「冬蟲夏草」的養(yǎng)殖

冬蟲夏草，又稱為夏草冬蟲，簡稱蟲草。全世界目前已報(bào)道發(fā)現(xiàn)由蟲草屬真菌Cordyceps寄生于昆蟲、蜘蛛和其他生物長出子實(shí)體的蟲草種類達(dá)400多種；我國已記錄68種。在國內(nèi)外一些人和學(xué)者的概念中，把凡是由蟲草屬真菌寄生并能產(chǎn)生子實(shí)體的菌物結(jié)合體都通稱為冬蟲夏草。然而，中國傳統(tǒng)的中醫(yī)藥學(xué)和我國絕大部分學(xué)者和人們及本文所指的冬蟲夏草，是特指僅分布于我國青藏高原及邊緣地區(qū)高寒草甸中的中華蟲草菌Cordyceps sienesis (Berkeley) Saccardo (1878)寄生于昆蟲綱、鱗翅目、蝙蝠蛾科、蝠蛾屬Hepialus幼蟲感病后形成的蟲、菌結(jié)合體;；而其他類群僅稱為蟲草，不是正宗的冬蟲夏草。

一、冬蟲夏草和寄主昆蟲的藥用歷史及發(fā)展現(xiàn)狀

藥用冬蟲夏草，最早的文字見于清朝汪昂的《本草備要》(1694)所載："冬蟲夏草，甘平，保肺益腎，止血化痰，止勞咳。四川嘉定府所產(chǎn)者佳。冬在土中，形如老蠶，有毛能動(dòng)，至夏則毛出土上，連身俱化為草。若不取，至冬復(fù)化為蟲。后來，趙學(xué)敏的 《本草綱目拾遺》(1756)一書中記載："夏草冬蟲，功與人參同，能治諸虛百損"，該書還對(duì)冬蟲夏草的產(chǎn)地、食用方法和用量有詳細(xì)的記述。1757年吳儀洛所著的 《本草從新》一書也指出：“冬蟲夏草保肺益腎、止血化痰�！逼浜� 《黔囊》、《文房肆考》、《四川通志》、《本草圖說》等數(shù)百部古藥書中都記載了冬蟲夏草。

我國把冬蟲夏草作為藥材出口到國外的歷史比文字記載的更悠久。從明代中葉1400一1465年間就從浙江傳到日本，并在貴族中廣泛食用。1723年由歐洲的傳教士尚加特利茨庫把從中國西北采到的冬蟲夏草帶到法國，由Reaumur在法國科學(xué)院的學(xué)士大會(huì)作了介紹，并登在會(huì)議紀(jì)要上；1943年，Berkeley鑒定了中國的冬蟲夏草，正式定名為：中國蟲草Sphaeri sienesis；1878年由Saccardo歸為蟲草屬Cordyceps，冬蟲夏草的研究在國外引起重視，中國蟲草也開始馳名于世。

冬蟲夏草由于僅分布于中國，又是數(shù)百年來我國和亞洲人民視為與天然人參、鹿茸相媲美的名貴滋補(bǔ)中藥材，享有極高的聲譽(yù)。它藥性作用溫和，比其他種類的滋補(bǔ)品更具有廣泛的藥用和食用性，長期以來是我國既可藥用又可食用的高級(jí)滋補(bǔ)品，并且一年四季都可食用，對(duì)老、少、病、弱、虛者皆宜服用，無任何副作用。古代70多部中藥學(xué)文獻(xiàn)把冬蟲夏草的功用歸納為:"能陰陽并補(bǔ)，治勞嗽膈癥，諸虛百損；功與人參、鹿茸同，但藥性溫和，老少病虛者皆宜食用??。"新中國建立以來，我國有200多部藥書詳細(xì)記載了冬蟲夏草的藥效與用途，歷部 《中華人民共和國藥典》記載其功用為："補(bǔ)肺益腎，止血化痰。用于久咳虛喘，勞嗽咯血，陽痿遺精，腰膝酸痛。"隨著國內(nèi)外醫(yī)學(xué)的發(fā)展和中藥學(xué)在全世界逐步普及，近年來發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草的功用效果越來越廣泛。經(jīng)研究證明，它是具有鎮(zhèn)靜，止血，抗驚厥，降壓，改善心肌缺血，抗血小板凝結(jié)，抗衰老，調(diào)節(jié)人體免疫和具有抗肺癌、淋巴癌和肝癌功能的藥物。目前越來越引起國內(nèi)外藥學(xué)界和生物學(xué)界研究者的重視，有關(guān)研究報(bào)道大量增加。 最早科學(xué)地描述和發(fā)表我國青藏高原有蝠蛾屬昆蟲分布是英國的Poujade1886年在四川省的寶興縣雪山上發(fā)現(xiàn)一種蝠蛾，被他定名為德氏蝠蛾Hepialus davidi；后來Alphe raky、Staudinger等學(xué)者分別于1889和1895年在西藏發(fā)現(xiàn)了暗色蝠蛾H.nebulosus（同種異名：泥色蝠蛾H.luteus)、異色蝠蛾H.varians兩個(gè)種類。1909年Oberthur在法國的Armorica半島上整理由中國西藏、四川帶去的藥材和植物標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)一頭蝠蛾成蟲，并以該半島名稱定名為H.armoricanus，但在發(fā)表新種時(shí)說明，該種蝠蛾產(chǎn)地可能是中國川藏高原，因在半島一直未再發(fā)現(xiàn)有該種蝠蛾分布；后來一直到1959年中國科學(xué)院動(dòng)物研究所科研人員在四川康定等地采到大量的蝠蛾成蟲和幼蟲，經(jīng)朱弘復(fù)鑒定，與在法國Armorica半島發(fā)現(xiàn)的蝠蛾是同一種，從而定名為蟲草蝙蝠蛾，并確定為中國特產(chǎn)的冬蟲夏草菌的寄主昆蟲之一。到目前為止，在青藏高原及邊緣地區(qū)已發(fā)現(xiàn)中國特有的冬蟲夏草菌寄主昆蟲37種。

二、冬蟲夏草與蝠蛾昆蟲人工培育和產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀

（一）有性型冬蟲夏草人工培育現(xiàn)狀

冬蟲夏草人工培育在近20年來全國先后有60多個(gè)科研單位和數(shù)千人進(jìn)行了大量的研究、實(shí)驗(yàn)和探索；云南、四川等地已在高海拔地區(qū)取得了小面積培育有性型成功的經(jīng)驗(yàn)，但由于周期長，高海拔地區(qū)無推廣對(duì)象、投資大、效益不如自然采集的高等多種因素，一直未能大面積推廣。在云南、四川、浙江、甘肅、青海、北京、福建、廣東、貴州、廣西等省(市、區(qū))中低海拔地區(qū)，開展人工培育有性型冬蟲夏草研究也有多年，雖然在某一些環(huán)節(jié)上已有多家取得了十分可喜的成績或成果，如云南和四川等省已在昆明、成都和重慶的室內(nèi)人工批量、重復(fù)繁殖成功蝠蛾昆蟲；浙江等地在室內(nèi)零星繁殖成功蝠蛾昆蟲;但由于沒有解決蟲與菌接種和批量、重復(fù)長出子座體的難關(guān)，不能稱為培育成功。離小面積、小批量、多次重復(fù)在低海拔人工培育出有性型冬蟲夏草的目標(biāo)都還十分遙遠(yuǎn)；雖然數(shù)家已聲稱在中、低海拔批量培育成功有性型冬蟲夏草，事實(shí)上科學(xué)的可信度極低。因?yàn)椋?/p>

(1)目前還無一家能長期又穩(wěn)定地分離培養(yǎng)到正宗的冬蟲夏草真菌 (即反復(fù)在培養(yǎng)基上批量長出子座)。青誨、云南、四川、北京等地在培養(yǎng)基上都培養(yǎng)出過子座，但其子囊孢子稀少或無子囊孢子，而且生長都不穩(wěn)定，不能說明已掌握了有性型人工在中低海拔的培育技術(shù)。

(2)冬蟲夏草菌無性型人工培養(yǎng)技術(shù)比較容易掌握，在室內(nèi)接種到蝠蛾幼蟲上也能感染成為僵蟲期，但確罕見有完成有性型，長出子座體和子囊孢子。

(3)目前子座的形成除了海拔、氣候、土壤、氣壓等多種環(huán)境因素外，其菌之間是否多菌復(fù)合感染?如果是復(fù)合感染，又是哪一些菌在起關(guān)鍵作用?在什么時(shí)期與冬蟲夏草菌起作用?等等問題尚不清楚。

因此，要在中低海拔地區(qū)人工批量和重復(fù)培育出有性型的冬蟲夏草，還需做大量的研究和實(shí)驗(yàn)工作。就是在高海拔地區(qū)進(jìn)行大面積人工培育冬蟲夏草，也還需開展許多技術(shù)性的實(shí)驗(yàn)工作。所以有性型冬蟲夏草人工培育要達(dá)到規(guī)模化或產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，研究還十分艱巨，路程還非常遙遠(yuǎn)。

(二)無性型冬蟲夏草人工培養(yǎng)現(xiàn)狀

由于有性型冬蟲夏草的人工培育困難太大，近10多年來，大部分開展冬蟲夏草人工培育研究的單位和研究人員都紛紛轉(zhuǎn)向無性型的研究與應(yīng)用上。由于蟲草菌無性型培養(yǎng)技術(shù)容易掌握，而且從自然界采集冬蟲夏草分離出來的真菌，絕大部分理化性質(zhì)和藥理功能與冬蟲夏草的有性成分相似，所以各地都把自我分離出的真菌確定為冬蟲夏草菌的無性階段，并紛紛建廠生產(chǎn)菌粉和開發(fā)應(yīng)用。目前已從自然界的冬蟲夏草體中分離出自我認(rèn)為是中華蟲草菌無性型共有9屬31種，其中有16種已經(jīng)在北京、吉林、山西、上海、青海、浙江、福建、江西、廣東、云南、貴州等19個(gè)省 (市)40多家，進(jìn)行深層大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)和固體培養(yǎng)菌絲體和分生孢子體作為有性型冬蟲夏草的代用品，部分廠家已進(jìn)入大的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，如至靈膠囊、金水寶膠囊、寧心寶膠囊、心肝寶、冬蟲夏草雞精、蟲草膠囊、冬蟲夏草酒、冬蟲夏草人參補(bǔ)酒等20多種產(chǎn)品年產(chǎn)值均達(dá)千萬元至數(shù)億元。而且，由于用菌絲體和分生袍子人工繁殖周期短、產(chǎn)量高，今后作為冬蟲夏草有性型的代用品，開發(fā)、應(yīng)用的潛力還極大。

三、冬蟲夏草和蝠蛾昆蟲人工培育技術(shù)

(一)冬蟲夏草茵的寄主昆蟲飼養(yǎng)繁殖技術(shù)要進(jìn)行冬蟲夏草的人工培育，首先必須大量人工飼養(yǎng)寄主一一蝠蛾屬昆蟲。蝠蛾一生中有98%的時(shí)間都在土壤內(nèi)生活，僅有2.5一13d的成蟲期營地面生活。所以，這類昆蟲的人工飼養(yǎng)管理主要是在土壤中開展。

1.蝠蛾的飼養(yǎng)工具

(1)蝠蛾卵的飼養(yǎng)工具。飼養(yǎng)蝠蛾卵可用兩種方法，一是用直徑15一20cm的玻璃培 養(yǎng)皿，墊上2一3層濾紙，皿內(nèi)放一塊吸水棉保持濕度，每皿可飼養(yǎng)200一500粒卵。此法利于觀察，但難掌握濕度。二是用l0cm xX5一8cm的廣口瓶或者25cm x 30cm的玻璃飼養(yǎng) 缸，內(nèi)置3一5cm厚的過篩細(xì)腐殖土，種上1一2棵珠芽寥植物，把卵放養(yǎng)于土表至lcm深的土層中，每瓶可飼養(yǎng)300一1000粒卵；飼養(yǎng)時(shí)只要掌握住植物不枯萎，即可不加濕度。此法卵的孵化率高，但觀察和移植幼蟲對(duì)比較困難。

(2)幼蟲的飼養(yǎng)工具有以下4種。

a.玻璃養(yǎng)蟲缸：用18一25cmX30一35cm的玻璃缸，也可用標(biāo)本浸泡缸，放置土壤15一25cm，種上幼蟲取食的植物，把剛孵化幼蟲移入缸內(nèi)，每缸可飼養(yǎng)10一30頭幼蟲。 b.地下養(yǎng)蟲箱：箱一般高30一50cm，寬20一25cm，厚3一5cm。飼養(yǎng)箱骨架用鋼筋 焊成，上面鋼筋做成提手，便于提動(dòng)；寬的兩面用3一5mm玻璃，便于觀察蟲體活動(dòng)；底 和兩個(gè)側(cè)面裝上16孔目的銅紗網(wǎng)，便于水分滲入。然后裝上土壤，種植飼料植物，每箱放養(yǎng)20一50頭幼蟲；在較堅(jiān)實(shí)的地上挖一個(gè)比飼養(yǎng)箱體積稍大和深的槽，把養(yǎng)蟲箱放入槽中，觀察時(shí)將養(yǎng)蟲箱提出地面，抹去外表玻璃上的土壤，即可清楚看到幼蟲活動(dòng)情況。

c.大型養(yǎng)蟲籠：在半自然的狀況下，選擇一塊排水好、土質(zhì)疏松的場地，挖長12一l5m、寬2一3m、深4Ocm的深槽，底部和四周墊上尼龍紗網(wǎng)(最好用雙層，小蟲不易鉆出)，再把疏松的腐殖土鏟進(jìn)填平，種上幼蟲食物，放入幼蟲飼養(yǎng)，每平方米可放養(yǎng)30一50頭；該法有利于大規(guī)模飼養(yǎng)，但觀察困難。

d.用各類盆具裸露飼養(yǎng)：把植物飼料洗凈放入盆中，放入幼蟲飼養(yǎng)，盆口覆蓋一層黑布或者黑紙遮光。此法利于生活史觀察，但要注意勤換飼料和清除糞便。

(3)蛹和成蟲的飼養(yǎng)工具。制作長50cm、寬50cm、高55一60cm的養(yǎng)蟲箱。底部用薄鐵板或雙層銅紗網(wǎng)封底；頂和四周用鐵紗或尼龍紗封蓋，前面可制成一道活動(dòng)紗網(wǎng)門。在箱底放入10一20cm的土壤，種上植物，把蛹和成蟲放養(yǎng)土中，此法可進(jìn)行密植飼養(yǎng)。

2.飼養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)

(1)土壤的選擇。土壤是蝠蛾昆蟲一生中最主要的活動(dòng)場所。土壤條件是否適合該蟲生活是人工飼養(yǎng)成活率高低的關(guān)鍵之一。最適宜蝠蛾生長的是高山草甸土；次之是流石灘和草甸混合土；再次之是高山棕色、暗棕色林土，其他土壤對(duì)此蟲生長不良。

(2)食料的選擇。幼蟲最喜取食圓穗蓼、珠芽蓼、黃芪、小大黃等植物的嫩根芽。由于蝠蛾昆蟲是一類雜食性昆蟲，在無上述植物的地方，可用禾本科 (如青稞、麥、谷芽等)；十字花科、莎草科的嫩根飼養(yǎng)。在中、低海拔地區(qū)(適宜生活的溫度下)用土大黃、胡蘿卜、白蘿卜、白薯 (紅苕)、馬鈴薯、蘋果等飼喂也能正常生長發(fā)育，最好為土大黃、胡蘿卜和白薯三類。

(3)溫、濕度的選擇。蝠蛾昆蟲是一類耐低溫而怕高溫的昆蟲。最適宜在15一19C中生活成長；此蟲最適宜空氣濕度75%一85%，土壤含水量40%一45%之間。

3.管理技術(shù)

(1)成蟲期。成蟲不取食任何食物，只要保持水分和適宜溫度即能正常成活和產(chǎn)卵。但蛾子棲息環(huán)境與產(chǎn)卵量有關(guān)。成蟲最喜選擇有杜鵑和蝠蛾幼蟲取食的蓼科等植物根旁產(chǎn)卵，所以在蛾子交配產(chǎn)卵前植上幾株相關(guān)植物最佳；另外不能有強(qiáng)光影響。

(2)卵期。要使卵能正常孵化，一定要掌握好適宜的溫、濕度。

(3)幼蟲期。幼蟲由于生長期長，而且蟲體壁薄而易破，飼養(yǎng)時(shí)一定要細(xì)心，除了必要的觀察、換土和換食料外，盡量減少翻動(dòng)。幼蟲的飼養(yǎng)關(guān)鍵是初孵的幼齡時(shí)期，初孵幼齡蟲要給足細(xì)小鮮嫩、濕度不高的食物；土壤最好經(jīng)過篩檢，以免粗硬物擦傷主體。此外，為了延長食料和土壤不霉壞，更換前用紫外燈照射殺菌l5min，土壤也可在陽光下暴曬1一2h后再用。

(4)蛹期。養(yǎng)蛹時(shí)，把養(yǎng)蛹器皿內(nèi)的土壤壓實(shí)，然后用與蛹粗細(xì)的木棍人工造一土室，土室略斜，深約2一3cm，每室放一蛹，放蛹時(shí)，蛹頭向土表面，上用細(xì)土蓋住。蛹的溫濕度，可控制在大氣濕度80%一85%，土壤含水量42一45%之間，溫度18一22℃之間。

[二]冬蟲夏草菌的人工培養(yǎng)技術(shù)

要獲得純正的冬早夏草菌種必須進(jìn)行人工的分離、純化、復(fù)壯、保存等工作。

1.分離冬蟲夏草菌的技術(shù)與條件

(1)材料要求。獲得純的菌種對(duì)材料要求比較嚴(yán)格；一般來說如果是進(jìn)行冬蟲夏草的組織塊分離法，最佳的分離材料是每年的10月底至11月份，青藏高原高寒草甸土壤剛開始凍結(jié)時(shí)期采的材料，這個(gè)時(shí)期冬蟲夏草菌剛感染蝠蛾幼蟲進(jìn)入僵蟲期不長時(shí)間，嫩小的子座芽剛長出蟲頭部0.2一0.5cm，蟲體內(nèi)其他雜菌較少，最易進(jìn)行分離。如果是第二年5一6月份采的材料，僵蟲體和子座上都有許多種雜菌共生或腐生，難獲得純菌種。若用子囊孢子進(jìn)行分離培養(yǎng)，材料最好在每年的7月中、下旬子囊孢子剛有部分成熟期采集分離培養(yǎng)。

(2)操作方法。有以下3步。

a.僵蟲體 (即菌核)的分離：分離前，用水刷洗干凈主體表面，再用無菌水清洗2一3次；用0.1%一0.2%的升汞溶液，對(duì)分離材料進(jìn)行約3一5min的表面消毒；再用無菌水清洗。選取與胸足為界的前段部分。用解剖刀切去表皮，避開消化道，取血腔菌絲切成芝麻粒大小，壓入平板培養(yǎng)基中，每皿1一2粒。置于15一19℃中培養(yǎng)，待菌落長出0.2一0.5cm時(shí)，挑選少量菌絲反復(fù)在平板培養(yǎng)基上分純2一4次，確定無其他雜菌后，移入試管保存和培養(yǎng)。 b.子座芽分離：從僵蟲頭頂切下洗凈的子座芽，置入0.1%升汞液中消毒2一3min，用無菌水洗凈，切取中間部位組織塊壓入培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件同a。

c.子囊孢子分離：用透明紙袋套住子囊孢子成熟的子座，讓子囊孢子彈跳粘貼在紙袋上，然后，把有子囊孢子的紙袋浸入25%的葡萄糖液中，洗下孢子，放入15一19℃中培養(yǎng)，每天鏡檢，當(dāng)袍子萌發(fā)時(shí)，用微吸管吸單個(gè)孢子滴于平板中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件同a。

也可把整個(gè)成熟的冬蟲夏草帶回室內(nèi)，用棉紙把僵蟲和連蟲體的子座包住，僅留出有孕部分，在無菌室中，橫放，下置一片載玻片，隨時(shí)保持主體濕度；每天鏡檢，當(dāng)看到子囊孢子彈到玻片時(shí)，用微吸管吸到平皿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件同a。

(3)培養(yǎng)基的選用。

a.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)，此種配方是所有蟲草菌屬真菌的通用培養(yǎng)基，在分離培養(yǎng)初期可用該配方，不過菌種生長不十分旺盛，而且易老化、退化。

b.加富培養(yǎng)基 (1)：多性蛋白臍10g，葡萄糖50g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，活蠶蛹30g，生長素0.5μg，瓊脂20g，加水1000mL，pH：5.0。

加富培養(yǎng)基 (Ⅱ)：蛋白脯40g，葡萄糖40g，去皮鮮馬鈴薯100g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，牛肉膏10g，生長素0.5μg，蝠蛾活幼蟲 (磨碎)30g，瓊脂20g，高寒草甸土浸出液10OOmL，pH：5.0。

在加富培養(yǎng)基上，菌落比在PDA培養(yǎng)基上生長旺盛和迅速；加富Ⅱ號(hào)又優(yōu)于Ⅰ號(hào)。

2.生長特性 冬蟲夏草菌的分離培養(yǎng)中須掌握溫度、pH值、光照、碳和氮源及無機(jī)鹽的利用狀況。

(1)不同溫度對(duì)菌絲生長的影響。冬蟲夏草菌喜偏低溫度。在0一4℃時(shí)能緩慢生長；5一8℃時(shí)生長速度加快；10一19℃是此菌較適生長發(fā)育的范圍;最佳生長溫度為15一l9℃。超過20℃菌絲猛長，菌落由白色變?yōu)榛液诨蜃攸S色，開始出現(xiàn)變異，所以不宜高溫培養(yǎng)。

(2)對(duì)pH值的要求。冬蟲夏草菌是一種偏酸性真菌，最適pH值為5.0一6.0，當(dāng)pH值為4.5以下和6以上時(shí)，隨著增高或降低，生長緩慢至不生長。

(3)光照的影響。此菌的子囊孢子萌發(fā)和菌絲生長初期，適應(yīng)于弱光和短光照，后期則適應(yīng)于較強(qiáng)光照。在人工培養(yǎng)中，菌絲、分生孢子和子座等具有明顯的趨光性，向陽面生長多而

密，背光面生長稀疏，全黑環(huán)境下培養(yǎng)的各種菌態(tài)纖弱、細(xì)長、稀疏。

(4)對(duì)碳源的利用。冬蟲夏草菌可利用多種碳源，但以葡萄糖和麥芽糖合用時(shí)生長最快，單用葡萄糖時(shí)也能良好地生長，次之是馬鈴薯等淀粉，再次之是蔗糖。

冬蟲夏草菌是一種由寄生活體寄主，再由腐生階段發(fā)育成熟的真菌，所以對(duì)氮源中的多種有機(jī)氮均能較好的利用。而以活蟲體最佳；蛋白胨與酵母膏合用生長也十分理想，次之是二者單獨(dú)使用，再次之是牛肉膏等。而對(duì)無機(jī)氮如硫酸銨、硝酸鉀等利用較差。

對(duì)灰分養(yǎng)料有一定的需求，在有微量的硫酸鎂、磷酸氫二鉀的培養(yǎng)基中生長旺盛，次之是磷酸二氫鉀，其他鈉、鈣、鐵、銅等無機(jī)鹽也可利用。

3.培養(yǎng)方式 冬蟲夏草菌分離純化后，即可作為各種實(shí)驗(yàn)和擴(kuò)大生產(chǎn)應(yīng)用。

(1)其擴(kuò)大生產(chǎn)的方法常有三種：固體靜置培養(yǎng)法、振蕩培養(yǎng)法和大罐通氣發(fā)酵培養(yǎng)法。 a.靜置培養(yǎng)：主要用在固體培養(yǎng)，如試管斜面、三角瓶培養(yǎng)、米飯培養(yǎng)等等。在靜置培養(yǎng)中只要掌握好溫度和光照即可使菌正常生長。當(dāng)斜面上的分生孢子成熟后，即可存入1一2℃的冰箱中保存8一14個(gè)月，也可作為種子直接用于生產(chǎn)。

b.振蕩培養(yǎng)：采用液體培養(yǎng)菌種或小規(guī)模繁殖培養(yǎng)，都可用振蕩培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)基，把固體培養(yǎng)基減去瓊脂即可。設(shè)備最好選用恒溫振蕩培養(yǎng)機(jī)，用三角瓶置液體培養(yǎng)基，把試管固體菌種接入即可培養(yǎng)。經(jīng)不斷振蕩使液體培養(yǎng)基中各種成分混合均勻而不致沉淀，同時(shí)促進(jìn)氣體與液體接觸和交換，使氧進(jìn)入液體培養(yǎng)基中，利于菌絲生長和分生孢子形成。 c.大罐通氣發(fā)酵培養(yǎng)：在大規(guī)模生產(chǎn)菌絲和分生孢子等菌粉時(shí)，必須用大罐通氣發(fā)酵培養(yǎng)法。該方法通氣是采用吸氣或真空泵減壓等方法，經(jīng)過濾器除雜菌，送入罐內(nèi)液體培 養(yǎng)基中供冬蟲夏草菌的生長發(fā)育。

(2)發(fā)酵工藝流程。自然冬蟲夏草分離純化→ 試管斜面種→ 振蕩器液體一級(jí) 種→ 二級(jí)種→ 小型種子發(fā)酵種子罐→ 生產(chǎn)發(fā)酵罐 → 濃縮→ 噴粉干燥→ 成品菌粉。

冬蟲夏草菌罐中發(fā)酵要求溫度在20一25℃，罐壓392.3一686.5kPa(0.4一0.7kg/cmz)，通氣量為0.5一1.OVVm*；注入發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基為罐容的65%一75%為宜。 接種量為10%，攪拌速度為180r/min，培養(yǎng)時(shí)間72一96h，即可放罐濃縮和噴粉。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基多用。鮮馬鈴薯 (去皮)8%，蔗糖2%，玉米淀粉0.5%，蠶蛹粉1%，蛋白胨0.4%，硫酸銨0.2%，pH值5.5一6.0。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)成品標(biāo)準(zhǔn)。分生孢子即幾全脫落母體孢子梗，孢子梗數(shù)量增加不明顯 時(shí)，在鏡下計(jì)數(shù)檢查，每毫升含分生孢子18億一25億個(gè)；殘?zhí)堑陀?%；氨基氮低于0.2mg/mL，即可成為成品菌液。

4.冬蟲夏草菌回接要點(diǎn) 把有性型或無性型的冬蟲夏草菌孢子回接到寄主昆蟲體上，是人工培養(yǎng)有性型冬蟲夏草和復(fù)壯無性型菌種的關(guān)鍵措施。

(1)回接時(shí)期。冬蟲夏草回接關(guān)鍵在于選擇寄主昆蟲抗菌薄弱時(shí)期，一是蛻皮期；二是幼蟲取食活動(dòng)激烈，摩擦損傷率較高時(shí)期。

(2)回接方法。又分兩種。

a.噴霧法：當(dāng)飼養(yǎng)的蝠蛾幼蟲達(dá)4一6齡蟲，有1/3以上的幼蟲蛻皮時(shí)，把幼蟲集中，用子囊孢子或者分生孢子對(duì)入5%一10%葡萄糖液噴霧到蟲體或食物上，接種后約30min，菌液在蟲體上略干，把幼蟲放回土壤中任其自然生活。此法感病率高，但缺點(diǎn)是，幼蟲不易從土中取出集中，而且集中時(shí)幼蟲有互相殘殺的習(xí)性，蟲體被咬傷后，易被雜菌感染致死，冬蟲夏草菌絲未充滿體腔時(shí)，傷蟲就會(huì)腐爛，不能形成僵蟲 (菌核)。

b.自然接觸法：在大面積半自然土壤中飼養(yǎng)蝠蛾幼蟲，定時(shí)取小樣觀察幼蟲生長狀況，當(dāng)大部分幼蟲適宜感病時(shí)，用飼料植物浸菌液種植和用細(xì)土拌菌接種，均勻撒入養(yǎng)蟲的地表上，然后噴水，使菌滲入土中，幼蟲取食活動(dòng)時(shí)接觸感染。此法寄主感染率不太高，但一經(jīng)感染致病，冬蟲夏草菌長勢好，而且未感病的蝠蛾幼蟲能正常生長，繁殖后代。

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