WB實驗組織總蛋白提取方法

WB組織總蛋白提取步驟

第一步提取組織蛋白上清液

1，準備裂解液

（1）溶PMSF（將PMSF晶體溶到PMSF溶劑中，即配成10ml100mM的PMSF液體）

（2）裂解液的制備

組成：PIRA裂解液+PMSF溶劑+蛋白酶抑制劑

10mlPIRA=100ulPMSF=1片蛋白酶抑制劑

（3）將配好的裂解液放在4℃?zhèn)溆谩?/p>

2，研磨組織（心尖）

（1）準備研缽，藥勺（2把），長鑷子，保溫箱（里面放入冰塊），湯勺，離心管，天平，手套（2幅），液氮，冰盤，振蕩器。

（2）將所有接觸到組織的工具用液氮預(yù)冷。

（3）1人負責(zé)將組織組織給研磨者并隨時加液氮（此人必須記住每次研磨者所研磨的組織的編號）2人研磨組織（多次快速），同時一人將1.5ml離心管編號預(yù)冷去皮。

（4）將研磨好的組織放在去皮處理的對應(yīng)的離心管中稱重。（用大白紙記錄好每個樣的'重量，便于離心時配平用）。

（5）加裂解液（1mg組織加6ul裂解液）。

（6）震蕩混勻后放入冰盤上，等所有的樣加完后一齊在搖床上搖1h。

3，離心提取蛋白上清液

（1）提前30min預(yù)冷離心機（4℃）。

（2）配平。

（3）離心，按照配平時的組放樣（13000r，5min）。

（4）取上清液，儲存在-20℃?zhèn)溆谩＃ㄌ崆皩?.5ml的離心管編號）。

第二步BCA法測蛋白濃度

1，37℃預(yù)熱水浴箱

2，配蛋白標準液

（1）準備9個1.5ml離心管并編號A,B,C,D,E,F,G,H,I

（2）按照說明書配制標準樣。

3，將蛋白上清液稀釋十倍

（1）準備0.5ml的離心管并編號。

（2）取上清液6ul，然后加入54ul蒸餾水，震蕩混勻。

2，配BCA工作液

RagentA：B=50:1

工作液所需用量計算：

總體積=（n待測樣+9標準樣）×2×200ul

其中A液xx，B液xx。

3，向酶標板（96孔板）中加入蛋白和工作液

先加25ul蛋白，再加200ul工作液，每個樣加兩個孔。

1234596孔板視圖6789101112

4，加完工作液后搖床搖30min，放入37℃水浴30min。（最好蓋上蓋）5，預(yù)熱酶標儀37℃

6，酶標儀使用方法

（1）打開MPM6軟件

（2）File-New

（3）文件-Intrument-Setup-Single-波長562nm-OK

（4）File-Readnewplate

（5）ExpertDate：Max

7，根據(jù)OD值的平均數(shù)用EXCEL計算濃度（記得x10）。

第三步制備上樣蛋白

1，計算500ul上樣蛋白組成

蛋白上清液+1x樣緩（固定5x樣緩100ul）+超純水（可用蒸餾水代替）

（1）計算500ul上樣量所需的蛋白體積

V蛋白=2ug/ul×500ul/實際蛋白濃度（ug/ul）（注意：2ug/ul可以根據(jù)實際情況調(diào)整的）

（2）計算所需超純水體積

V水=500-100-V蛋白

（3）數(shù)據(jù)用excel計算并提前打印。

2，準備1.5ml的離心管編號。

3，將提前將5x樣緩取出解凍。

4，按照excel表中數(shù)據(jù)在離心管中加入蛋白上清液，樣緩以及超純水。5，震蕩混勻。

6,100℃水浴15min。

7，分裝備用。

作者：尹懿

北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院2012級本科

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