western蛋白提取步驟

蛋白提取方法

一、對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：

1. 融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升（6cm培養(yǎng)皿200-300ul）裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2 秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。

對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。

3. 在冰上充分裂解20-30min后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

裂解液用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150微升或200微升。

二、對(duì)于組織樣品：

1. 把組織剪切成細(xì)小的碎片。

2. 融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

3. 按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高 濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)

4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上

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