蛋白提取方法
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 組織和細(xì)胞的來(lái)源：
1.1.2 儀器設(shè)備
機(jī)械組織勻漿器
低溫高速離心機(jī) (>40,000 g)
超速離心機(jī)
超生細(xì)胞破碎儀
超純水裝置
1.1.3 試劑
三氯醋酸 (TCA)
丙酮
二硫蘇糖醇 (DTT)
尿素
CHAPS
PMSF
EDTA
乙醇
磷酸
考馬斯亮藍(lán)R350
抑肽素A
亮肽素
試劑純度均應(yīng)是分析純或以上。
1.1.4 溶液配制
(1) PBS：
NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl調(diào)pH至7.4，用純水定容至1 L；
(2) EDTA 儲(chǔ)存液：
18.61 g Na2EDTA?2H2O，溶于70 ml純水中，用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0 (約需2 g NaOH顆粒)，定容為100 ml�？筛邏簻缇蠓盅b備用；
(3) 亮肽素儲(chǔ)存液 (50 μg/ml，100×)
10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用時(shí)配成50 μg/ml儲(chǔ)液，-20℃保存；
(4) 抑肽素儲(chǔ)存液 (70 μg/ml，100×)
1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用時(shí)配成70 μg/ml儲(chǔ)液，-20℃保存；
(5) PMSF儲(chǔ)存液 (10 mM, 100×):
17.4 mg PMSF，溶于1ml異丙醇中，-20℃ 保存。
DTT 儲(chǔ)存液 (1 M):
0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理，可過(guò)濾除菌)。
(7) 裂解液:
Lysis buffer A
(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer B
(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer C
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O
Lysis buffer D
(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)
Lysis buffer E
(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer F
100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)
●CA、蛋白酶抑制劑混合物和DTT在臨用前加入。
蛋白酶抑制劑混合物[3]
成分 終濃度
蛋白酶抑制劑混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM
EDTA 0.3 mg/ml (1 mM)
抑肽素 0.7 μg/ml
亮肽素 0.5 μg/ml
1.2 方法
1.1.1組織蛋白提取方法
1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]
(1)冰上取材，稱(chēng)濕重，置液氮中凍存或直接進(jìn)行下一步；
(2)在液氮中研碎樣品或使用機(jī)械勻漿器磨碎組織；
(3)將粉末懸浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中；
(4)蛋白–20℃沉淀過(guò)夜；
(5)35000×g(6℃)離心30min；
將沉淀重懸于含0.2%DTT的預(yù)冷丙酮中；
(7)-20℃放置1h；
35000×g(6℃)離心30min；
(9)在通風(fēng)櫥中讓丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀；
(10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg組織需要1ml裂解液）；
(11)15℃,40000×g，離心1hr；
(12)用Bradford法[2]測(cè)定上清的蛋白濃度，分裝后置–75℃保存。
1.2.1.2超速離心法
(1)取材；
(2)用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每1g樣品加入0.5ml裂解液，使用組織勻漿器勻漿30s；
(3)組織懸液15℃，10000×g離心10min；
(4)上清液4℃，150000×g超速離心45min；
(5)小心避開(kāi)上層漂浮的脂質(zhì)層，吸取離心上清6℃40,000g再次離心50min；
取離心上清。Bradford法定量，分裝后置–75℃保存。
1.2.2培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取
1.2.2.1循環(huán)凍融法
(1)吸出培養(yǎng)液棄去，0.01mol/LPBS洗一次；
(2)加入PBS，用橡膠刮收集細(xì)胞于10ml離心管中；
(3)500×g，離心5min；
(4)棄上清，PBS洗三次（室溫,500×g，5min），
(5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細(xì)胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中；
執(zhí)行Biofuge存儲(chǔ)程序8，500×g5min離心；
(7)用200μl微量加液器吸出PBS，棄去；
吸干殘留的PBS，估計(jì)樣品體積，加入5倍體積裂解液，巴氏滴管混勻，液氮中反復(fù)凍融三次(每次置液氮中3s，室溫融化)，DTT在第一次凍融后加入；
(9)執(zhí)行Biofuge存儲(chǔ)程序6，15℃，40000×g，離心1hr(Biofuge)；
(10)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2.2超聲破碎法
(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液棄去，0.01mol/LPBS洗一次；
(2)加入PBS，用橡膠刮收集細(xì)胞于10ml離心管中；
(3)室溫，500×g，離心5min；
(4)棄上清，PBS洗3次（室溫,500×g，5min）；
(5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細(xì)胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g離心5min；
吸干殘留的PBS，估計(jì)樣品體積，加入5倍體積裂解液，混勻，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超聲破碎細(xì)胞（3×10s）；
(7)15℃,40000×g，離心1hr(Biofuge)；
上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2結(jié)果和討論
蛋白質(zhì)提取的基本步驟包括清洗組織或細(xì)胞、裂解細(xì)胞、離心除去膜組分等獲得溶解的蛋白質(zhì)上清。
我們破碎細(xì)胞采用循環(huán)凍融法和超聲波法；破碎組織采用液氮研磨法和機(jī)械勻漿法。循環(huán)凍融法操作簡(jiǎn)便，比較適合提取培養(yǎng)細(xì)胞的穩(wěn)定蛋白，我們后期實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞主要采取這種破碎方式。使用超聲破碎必須注意的是控制強(qiáng)度在一定限度，即剛好低于溶液產(chǎn)生泡沫的水平。因?yàn)楫a(chǎn)生泡沫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，同時(shí)要注意散熱。勻漿是機(jī)體軟組織破碎最常用的`方法之一。由于勻漿過(guò)程中蛋白質(zhì)被蛋白酶降解的可能性較小，所以勻漿是簡(jiǎn)便、迅速和風(fēng)險(xiǎn)小的組織破碎方法，我們實(shí)驗(yàn)室在破碎腦和脊髓組織時(shí)常用此法；由于神經(jīng)組織比較柔軟，液氮研磨法也很適合，本實(shí)驗(yàn)中我們使用了這一方法破碎大鼠脊髓組織，中樞神經(jīng)組織由于富含脂類(lèi)，沉淀法和高速離心法可以使蛋白和脂類(lèi)干擾物質(zhì)有效分離，但沉淀法的缺點(diǎn)是再溶解時(shí)蛋白損失嚴(yán)重。高速離心的缺點(diǎn)是需要樣品量大，如BeckmanL7-65超速離心機(jī)的離心管容量為8ml，不適用小量樣品的制備。
在眾多的裂解液配方中，我們主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%兩性電解質(zhì)加蛋白酶抑制劑混合物，原因是這一配方經(jīng)長(zhǎng)期使用很穩(wěn)定，裂解效率也較高，非常適合小量細(xì)胞蛋白提取要求。針對(duì)富脂的中樞神經(jīng)組織中脂類(lèi)物質(zhì)與蛋白相互作用，高濃度的尿素可以造成強(qiáng)變性條件(但如果再提高尿素濃度，尿素就容易析出，影響蛋白的溶解)，過(guò)量的去污劑也可以減少脂類(lèi)的污染，兩性電解質(zhì)可以提高蛋白的溶解度，同時(shí)
有利于等待聚焦。早期我們加入Tris堿以防止蛋白的水解，但是由于鹽離子的引入，導(dǎo)致IEF電壓過(guò)低，影響聚焦。
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