蛋白提取步驟
蛋白提取步驟
準備裂解液、蛋白酶抑制劑。
1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制劑）
2、取0.1g組織，充分剪碎后加入研磨器中，加入適量液氮，將組織研成粉末狀。
3、將研磨后的組織轉(zhuǎn)至加有裂解液的2mlEP管中。
4、冰上超聲（超聲3s，停6s）共計20個循環(huán)，30%能量。
5、冰上靜置30min，每10min震蕩1次。
6、12000rpm，4℃離心30min。
7、收集上清，測濃度后-70℃保存。
8、煮蛋白時加5微升上樣緩沖液。
2．培養(yǎng)的細胞（定量）：
⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。
⑵ 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶ 用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g離心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清進行定量。
⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
3．組織：
⑴ 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
⑵ 12000g離心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清進行定量。
⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
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