總蛋白提取
、一胞裂解物的制備：
細(xì)．1單去污裂劑緩沖液：1解%N-4P或0Titorn -X10 0裂解緩液沖系： 體
N-P4 o0 Tritonr10-01% T
rs-iCH (lpH 8.0)50 mmlo/L Na
lC1 50mml/L oP
MF（苯甲基S酰氟）磺 01.momlL/(001gμ/l)m Pe
ptasitn胃蛋(酶白制抑劑) 1moμlL(/0.μ7g/m)
leLpuetipn（抑亮肽制 0.5mg）ml /
pAortiinn（蛋抑白酶） 肽0.3moμ/L(l1μ/gl) m
（注：MPS F貯存液1：00mmo/Ll即714m./mg于異丙醇l； 中
Aroptinni貯 液：10mg/存ml于0溶.0m1o/LHElESPp(8.0)H; L
eueptinp 貯液存1：0m/gm溶l水于中；
ePptasitn 貯存 10液mgml于甲醇/中.液均于20-℃存保 ）操
作程序 ：* 離
收心1×10集 個(gè)細(xì)胞7
加*4入預(yù)冷1℃N%-P0裂解410液0μl
*烈劇蕩震細(xì)使胞充懸分浮勻混如為組織進(jìn)行勻漿（） *
4放℃15置~0mi3n
* 4℃心離，1 0500rm,1p0in， 取上清備用。m
二、蛋質(zhì)濃白度測(cè)定
：.簡(jiǎn)單1：的用28n0測(cè)m光值吸標(biāo)準(zhǔn)，線 曲2
精.的：用bio確r-d a劑試盒具，見(jiàn)體件 附三
、丙聚酰烯胺凝電泳（SDS-膠APGE）
樣和品層積中含膠rTsi-l(CHp6.)，上下槽8緩沖含液rTs-甘i酸(氨p8H3)，.離分中膠含rTi-sl(CH8.8)p的。統(tǒng)系所中組分有含都0.1有的％DSS，樣品和積膠中的層離氯形子成動(dòng)界面的移導(dǎo)先界邊而甘酸氨分則子成組尾隨邊界在，移動(dòng)界面兩的界之間邊是一導(dǎo)較電低電而位度較梯的區(qū)陡域它推，動(dòng)品樣的中肽多前移在分并離膠前積沿聚此處pH值較高，，利于甘氨有的酸子化離，所成的甘氨酸形離穿子堆過(guò)的集多并緊隨氯肽離之子后，分離沿泳動(dòng)膠從。移界動(dòng)面中解后脫S，D多S復(fù)合肽成物一電位pH和值勻的均區(qū)泳帶動(dòng)過(guò)分離膠，并穿篩被分依而各的大小得到自離。按所需分離分蛋白的質(zhì)分子小選擇大適的丙合烯胺百分比濃度酰一般，，5地％的凝膠可于用6～020k0Da的SD變S蛋白質(zhì)性分子的分，離01％于用6170kD～a15％，用1于2～54Dk。 a（
一）材、料 ：1
30．%（WV/）car凝y貯存膠 液丙
酰胺烯 9g，2亞甲 雙丙烯胺酰 1g加ddH2O 溶 1至00lm,新華濾紙過(guò)濾，棕用色中瓶4保存，℃月后重新配制。數(shù)
2 1..5ol/m TLis-rHl pC 8H.8
risT abe s1.851 g
加dd2O 5H0lm,加濃酸鹽pH 至.8(84約ml,讓溶液)卻至室溫冷再用d，Hd2定O容至100ml.
.3 1.0ml/o TLrsi-Cl pHH6 8.
Tris abse 2.11 g加
ddH2O 05lm,加濃鹽酸p至H6. 8約8ml),讓溶(液冷至室卻，溫用再dH2Od容定10至0lm .
4．.05mo/L lrTs-HCil ,Hp6.8
Tris b sa e.60g
加 6ml dd02OH加,鹽濃酸p至 6H.,定容至801ml 05.
1%0 DSS:S SD01克，溶于dd2OH 001lm
6.1.% 0硫酸銨過(guò)APS（）：過(guò)硫酸提銨驅(qū)供丙烯酰動(dòng)和亞胺丙烯甲胺酰合聚必所的需由自基過(guò)硫。酸100m銨g溶于d，H2dO 1ml .溶后解裝，-2分0度保。 存
7TEMED .（四甲基乙胺二T）MEE通過(guò)催化過(guò)D硫酸銨成自形由基而加速烯丙酰胺N和N’-,亞丙甲烯酰的胺聚合
.8 Tis-甘氨酸電r泳沖緩,液 p H.3 （ 5 8
×貯液）存 ：rTi sabs e5.11g 甘
氨 7酸g2
10%SD 5S0ml 或S（SD 50.g
）加dH2O至d010ml0
.96×樣品沖液緩10ml0 0
5.mo/l Tris-HCL(lHp68) 7.ml06(m0olmL)/
甘油 03l(m2%)
S5SD 1g
0DT T.93g 溴
酚 1藍(lán)2mg
ddH O 2100
至4�！鏀�(shù)周，或存-20�！鏀�(shù)月存DTT或（B者M(jìn)E用前加在）
入()二操、方作：
1．將玻法板洗干璃，固凈于電泳槽定；
上2．實(shí)按要驗(yàn)求制配不同度的濃離膠分，入T加MED后E迅速灌膠留，灌出注濃縮膠需所空間梳（子齒長(zhǎng)再加1的cm），上用部或30水乙%醇封面或0（1%.DS(S丙烯酰濃度胺≤8)%異丁醇或丙（烯胺濃�！荻�01））% 。
．3制濃配膠縮：實(shí)驗(yàn)要按配制不求濃同的度離膠分一次，使性塑料管中配用制適合積體濃度的與濃縮膠加，入ETME后應(yīng)D速快旋混合轉(zhuǎn)，速迅入濃縮膠。 灌
．灌注4濃膠：待縮離分完膠全合后（約聚03mi）,傾n出蓋層液覆，dd用H2O滌洗膠凝頂數(shù)部次以，除未去合的丙聚酰烯胺，用再紙小條吸濾凈留的液體殘，配制好縮膠濃迅后速入灌，立并在即縮濃膠中液入插凈的干梳,子再入加縮濃溶膠，以充液滿梳子間的隙空梳子用用前水洗清干，凈用前用臨乙醇擦拭揮發(fā)，至），確干無(wú)氣保泡；待膠完全聚合凝后3（m0in,）心取出梳小子清洗加，槽，樣凝膠放將入泳電槽；將電泳內(nèi)緩液加入沖內(nèi)電脈外中槽使凝膠的上，端均能浸下泡在沖液中緩，除加排孔樣內(nèi)可的空能。 泡
．樣5處品：理將白蛋樣品質(zhì)與×6SS樣品D理液處（25μl5+μl）在，一子個(gè)PE中混管合，01℃0加熱1min0，浴冷卻冰離，1心,加s； 樣6
加．：用微量加樣樣器將白蛋樣質(zhì)品（體總在40積μ內(nèi)l，按測(cè)照蛋得的白，量算相對(duì)得加入體積數(shù)）加的樣品入的底孔部，隨料水平染高升升而高射注針頭器�？酌繕拥纳献畹按蟀祝�2量040~gμ為了避。邊免緣效應(yīng)，未加在孔中樣加等入量樣品緩沖液. 的須加體等積空的1×白DSS品緩沖樣液以防，相泳鄰道品的樣散擴(kuò)。
7 ．泳電：電極插將與頭適當(dāng)電極相連的電，應(yīng)流流陽(yáng)極向；將壓電調(diào)至80V跑完，濃縮膠后，將電升壓高到100－201，V料的染前遷移沿至凝的膠部,底關(guān)閉源，電拔電掉極插頭從電，槽中泳出取膠玻凝板，小心移動(dòng)兩玻璃璃間的隔板，將片插入兩塊其玻板的璃一角，輕撬開(kāi)玻輕板璃凝膠，于其中的一貼塊上于，左邊一孔凝最下膠切去部一角以標(biāo)凝膠的示向，方用印跡分析于則，不角。切
．8色染：考斯亮馬藍(lán)染色
考馬 亮藍(lán)染斯：考液斯亮藍(lán)馬-R52 0.1 甲醇g 405lm dHdO24 0m5 冰醋酸 10lml 過(guò)濾0常溫保，存 ；
馬考斯亮藍(lán)脫液：色甲 醇 45m l醋冰 1酸ml0d Hd2 O4m5
將l凝膠于染色液中置至少5倍（體積染的液浸泡凝膠，）于搖床平放上臺(tái)室溫染，4色時(shí)以小，上移凝膠并回收染液，出再
將凝膠浸于脫泡色液中仍，置搖于平床臺(tái)，上色4脫~8時(shí)小，間其換脫色3~液次4（脫色容器中一放小塊海以綿吸洗附脫來(lái)下的染料。 ）四
蛋白、從質(zhì)SDS聚烯丙酰凝胺轉(zhuǎn)移膠固至支相持
(體一)儀器電轉(zhuǎn)移裝、：置CN，PVFD膜W、hamatnMM濾３、搖床等紙
（）、二電移緩沖液：轉(zhuǎn)甘氨2酸9.gT rs 堿 5i.g SD8S .07g3甲 醇200ml 加
ddH2O1至000m l
（三、）作操聚：（濕步：相同-轉(zhuǎn)7V，02，h4V1 ）
1．dHdO清2電洗極板吸水，揩干液滴；紙
2戴手．，切套6濾紙張1與張PVF膜，與D凝膠大小致一并，標(biāo)；記
3 P．DFV膜先于泡10%甲0醇ddH，O漂洗2m５i,n浸入轉(zhuǎn)電移液中注，驅(qū)意濾膜除的氣泡；
上．在4淺托一中盤(pán)入加少量電轉(zhuǎn)移液，的把張３６M浸泡M其中；于 5．安裝
移轉(zhuǎn)裝置
a：平．放部底極電陽(yáng)（），石墨極邊朝一； 上
b．這一電在極放置３上張轉(zhuǎn)移用浸泡液的過(guò)３MM濾，疊放紙對(duì)齊，后用然 玻移璃液作滾管，擠筒出濾紙間的'有氣所；泡
c．P DVF膜置放濾于上，精紙確對(duì)齊并排，氣泡；
出．從電d槽上撤出泳置放膠凝玻的，把凝璃膠轉(zhuǎn)移一盤(pán)去離子至水中為漂略洗，后然準(zhǔn)確放平PV于D膜上F把凝前，左下角置的膜的于標(biāo)記角上排，除氣； 泡e
把后３．濾張紙置在放膠凝上方同樣，確保層各確對(duì)齊精不，氣泡。留
６．將靠上 的電方極（陰）放極于層物上，平石一墨邊下朝，接連源，電據(jù)凝根面膠按0.積65A/mc2m接電通，流轉(zhuǎn)移１小電時(shí)左右；干轉(zhuǎn)半0.是3A0電(壓從4可伏到1上2伏右)
左７斷開(kāi)電源，．拆除轉(zhuǎn)移置裝去除，層，把各膠轉(zhuǎn)移凝至至盛考有斯亮藍(lán)馬染的托液中盤(pán)行染色進(jìn)，以檢查蛋質(zhì)轉(zhuǎn)白是移否全完，PV將F膜浸泡D于離子水中去驅(qū)除氣泡，然后，用春紅Ｓ麗進(jìn)染行色
五。、固定于PVD對(duì)膜上的F白質(zhì)蛋進(jìn)行色染
采用春紅麗染色Ｓ：麗春法S紅染色可法所有與疫免檢學(xué)方測(cè)兼法容，這是為因該料只染短暫顯色會(huì)而且在進(jìn)行Wetsren印跡時(shí)可被洗。去因此麗，春紅染色S不影響隨并用后于測(cè)抗檢的原色反顯，應(yīng)些這顯色應(yīng)反由是偶已抗聯(lián)的堿性體酸酶或乳磷氧化物酶等過(guò)催化的然而，由。于其顯示紫的紅色容不易攝拍來(lái)，這下染色不種提供永久能性驗(yàn)記實(shí) 錄�。保�10x麗春
Ｓ貯紅液存：春麗紅２Ｓ,g三 乙氯3酸g,0 磺水楊基30g酸加，水至001l
m�。玻ǎ悍�
a. 把濾放入膜有麗春紅Ｓ含使用的液盤(pán)中托色染510m~in,輕搖，
.b蛋帶出現(xiàn)后，白室溫用dd于2H漂O洗，間換期數(shù)次水； 六
、閉封特異非性結(jié)位合點(diǎn)
將 放膜入可熱加接封的料袋塑，中據(jù)根膜面，以0積.1l/mm2c的加量入閉液（5封%脫奶粉脂0，.%1Ｔeen w20P于B或SBS），盡T可排除能氣泡，密，平放封搖于床平臺(tái)上，溫溫室１育２小～時(shí)
七、 。
一抗
取出膜在PBST洗滌5中imnX3；將膜次入可加熱放接的塑封袋中料，加合入適度的濃抗一室，溫育溫小2時(shí)或3 C 71時(shí)小
、二八 抗取
出膜在PBST洗滌15中mniX3次將膜放入可；熱封加接的料袋塑中加入合適濃度的二，，室溫抗溫1育時(shí)或小73 C 05.小時(shí)
，九E、CL光檢測(cè)
發(fā)出取膜在PSB中T洗滌5inXm3次；平整的吸水用輕輕吸紙膜去表水面分將，膜入浸CL反應(yīng)液E（中A和B等液積混體后立合使即），用溫室1mn
i、十暗
吸室液體去用，食保品膜鮮蓋覆，在暗室用線X曝片光，影顯定影后、察觀果。結(jié)最后 片壓可以時(shí)多壓一，半小會(huì)時(shí)差多，背不的景況下情你可，以多壓幾張子片，很多況都是情因背景太黑為，看見(jiàn)膜，看光見(jiàn)不帶，連，續(xù)幾張，膜的壓背就減輕景了
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