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離體蛙心灌流-第四組
交大醫(yī)學(xué)院：離體蛙心灌流設(shè)計實(shí)驗(yàn)
第四組：
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1．學(xué)習(xí)離體蛙心灌流法。
2．觀察內(nèi)環(huán)境變化因素的相對恒定對維持心臟正常節(jié)律性活動的重要作用。
3．對遞質(zhì)、受體阻斷劑的概念有初步的感性認(rèn)識。
【實(shí)驗(yàn)原理】
1.心肌具有自動節(jié)律性收縮的特點(diǎn)，離體蛙心在任氏液中仍能較長時間保持其生理特性（自動節(jié)律性、興奮性、傳導(dǎo)性、收縮性）。
2.心收縮力和心輸出量是衡量心肌生理功能的重要影響指標(biāo)。采用離體蛙心灌流裝置可以向任氏液中加Na+、K+、Ca2+、腎上腺素、乙酰膽堿等化學(xué)遞質(zhì)來學(xué)習(xí)和掌握影響心肌生理功能、心收縮力、心輸出量的體液因素。
【實(shí)驗(yàn)動物】
蟾蜍
【實(shí)驗(yàn)器材和用品】
PowerLab 8S主機(jī)，橋式放大器，蛙類手術(shù)器械，玻璃蛙心插管，鐵支架，張力換能器，蛙心夾，任氏液，0.65%NaCl溶 液，3%CaCl2溶液，1%KCL溶液，1:10000腎上腺素溶液，1:10000乙酰膽堿溶液，3%乳酸溶液，2.5%NaHCO3溶液。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1.暴露心臟：損毀蟾蜍腦和脊髓，將其仰臥位固定在蛙板上，用鑷子提起胸骨后端腹部的皮膚，用粗剪刀剪一小口，然后由切口將剪刀伸入皮下，向左右兩側(cè)鎖 骨外側(cè)方向剪開皮膚，并向頭端掀開皮膚。用鑷子提起胸骨后端腹肌，在腹肌上剪一小口，將手術(shù)剪伸入胸腔內(nèi)，緊貼胸壁（以免損傷下面的心臟和血管），沿皮膚 切口方向剪開肌肉，再用粗剪刀剪斷左右鳥喙骨和鎖骨，使創(chuàng)口呈一個倒三角形。用眼科鑷提起心包膜，并用眼科剪將心包膜剪開，暴露出心臟。
2. 觀察心臟的解剖：在腹面可以看到一個心室，其上方有兩個心房。心室右上角連著一個動脈干，動脈干根部膨大稱為動脈圓錐，也稱主動脈球。動脈向上分成左右兩 支，用玻璃分針從動脈干背面穿過，將心臟翻向頭側(cè)。在心臟背面兩心房下端可看到顏色較紫紅的膨大部分，為靜脈竇。靜脈竇是兩棲類動物心臟的起搏部位，它與 下腔靜脈相連。靜脈竇與心房的交界處稱竇房溝，而心房與心室的交界處稱房室溝
3.心臟插管：用蛙心夾于心舒期夾住心尖，手提蛙心夾上連線將心臟輕輕提起，看清結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)備插管。在主動脈下穿一棉線，打一松結(jié)，用眼科剪在左主動脈上 向心臟方向剪一小斜口，切口的深度小于管壁直徑的1/2，以免插管時血管撕斷。把裝有任氏液的蛙心插管插入左主動脈，插至主動脈球后稍稍后退，在心室收縮 時將插管沿主動脈球后壁向心室中央方向插入，經(jīng)主動脈瓣插入心室腔內(nèi)。當(dāng)插管內(nèi)的液面隨心搏上下移動時，說明插管已插入心室腔內(nèi)。將預(yù)先打 好的松結(jié)扎緊，并將線固定在插管壁上的玻璃小鉤上，使結(jié)扎牢固。用
滴管吸去插管中的液體，更換新鮮的任氏液。小心提起插管和心臟，剪斷左右側(cè)動脈分支和腔 靜脈等（注意勿損傷靜脈竇及兩心房），將心臟摘出。用任氏液反復(fù)沖洗插管直至插管內(nèi)任氏液完全澄清為止。
4．固定支架：把蛙心插管固定在鐵支架上，蛙心夾上的連線和張力換能器相接。張力換能器頭端略向下傾斜，以免藥液滴入換能器內(nèi)造成損壞。連線應(yīng)和水平面保持垂直，松緊適當(dāng)
5.儀器連接及程序設(shè)置
6.觀察項(xiàng)目：
（1）記錄正常心肌收縮曲線。適當(dāng)調(diào)節(jié)channel 1 的 Range 和基線位置。得到滿意的心跳搏動曲線。注意觀察其中哪一部分代表心室收縮，哪一部分代表心室舒張。
（2）在任氏液中加入3%CaCl2溶液1~2滴。觀察和換液同前。
（3）在任氏液中加入1%KCl溶液1~2滴，觀察和換液同前。
（4）在任氏液中加入1:10000腎上腺素溶液1~2滴，觀察和換液同前。
（5）在任氏液中加入1:10000乙酰膽堿溶液1~2滴，觀察和換液同前。
（6）在任氏液中加入3％乳酸溶液1~2滴，觀察和記錄心博變化，然后加入2.5%NaHCO3溶液1~2滴，觀察其恢復(fù)過程，然后換液。
（7）待各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)步驟完成后，單擊Start/Stop切換按鈕停止記錄。選取各實(shí)驗(yàn)步驟的波形，把所需的內(nèi)容按先后順序分別黏貼在時間軸的末尾。
（8）打印上述黏貼的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【注意事項(xiàng)】
1. 心室插管時不可硬插，以免戳穿心壁，而應(yīng)順著主動脈走向并在心室收縮時插入。
2. 摘出心臟時，盡量多留些組織，以免損傷靜脈竇。
3. 每個觀察項(xiàng)目前后都應(yīng)用任氏液進(jìn)行對照記錄。
4. 各種藥液滴管要專用，不可混淆。每次加液的量不可過多，以剛能引起效應(yīng)為度。
5. 每次加藥后最好用洗凈的細(xì)玻棒攪動幾下，以免藥液浮在上層，不易進(jìn)人心臟。
6. 除最后一項(xiàng)外，每個觀察項(xiàng)目時插管內(nèi)液面高度保持一致。
藥品清單
1.任氏液
2. 3%CaCl2溶液：無水氯化鈣或2水合氯化鈣（配制時注意分子量的差別）
3. 1%KCl溶液: 氯化鉀
4. 1:10000腎上腺素溶液：鹽酸腎上腺素
5. 1:10000乙酰膽堿溶液：氯化乙酰膽堿粉劑
6. 3％乳酸溶液: 乳酸
預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
（1）加入2%CaCl2后，收縮的幅度變大，心率變快，甚至達(dá)到強(qiáng)制收縮。
（2）加入1%KCl后，收縮的幅度降低，但心率變慢。
（3）加入腎上腺素，根據(jù)所得數(shù)據(jù)，心肌的收縮變大，心率變快。
（4）加入1:10000乙酰膽堿，收縮的幅度變小，心率變慢。
（5）3%乳酸灌流H+與Ca2+競爭肌鈣蛋白， Ca2+不能與肌鈣蛋白結(jié)
合，心肌收縮力↓
正常時的心肌收縮曲線：
加入2%CaCl2后后的收縮曲線：
加入1%KCl后收縮曲線：
加入腎上腺素后的收縮曲線：
加入1:10000乙酰膽堿后的收縮曲線：
加入3%乳酸灌流后的收縮曲線：
實(shí)驗(yàn)分析
1.作為蛙心起搏點(diǎn)的靜脈竇能按一定節(jié)律自動產(chǎn)生興奮。因此，只要將離體失去神經(jīng)支配的離體蛙心灌流-第四組蛙心保持在適宜的環(huán)境中，在一定時間被仍能產(chǎn)生節(jié)律性興奮和收縮。另一方面，心臟正常的節(jié)律性活動有賴于內(nèi)環(huán)境理化因素的相對穩(wěn)定，所以，改變灌流液的成分，則可以引起心臟活動的改變。從蛙心正常心搏曲線可以看出.
2.給蛙心灌入2%CaCl2溶液后蛙心搏曲線,與圖一比較發(fā)現(xiàn)此時心肌細(xì)胞收縮力顯著增強(qiáng).并且心率變快.這是因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞外液鈣離子濃度顯著升高時胞膜內(nèi)外鈣離子濃度梯度增大,一方面慢反應(yīng)細(xì)胞4期自動去極速度加快,心肌自律性增強(qiáng),心率也就增大:另一方面工作細(xì)胞動作電位期間鈣離子內(nèi)流量加大導(dǎo)致肌漿鈣離子濃度增大甚至持續(xù)增大,這樣鈣離子與肌鈣蛋白的結(jié)合量增多甚至它們只結(jié)合不解離,最后心肌收縮力增強(qiáng)或者心肌持續(xù)收縮。
3.給蛙心灌入1%KCl溶液后蛙心搏曲線,與正常時比較發(fā)現(xiàn)此時心肌細(xì)胞收縮力降低.當(dāng)細(xì)胞外液鉀離子濃度輕度升高時一方面鉀離子抑制鈣離子內(nèi)流使鈣離子內(nèi)流量減少,這樣鈣離子的興奮偶聯(lián)作用減小心肌收縮力降低.另一方面膜內(nèi)外鈣離子濃度梯度減小,使心肌細(xì)胞膜靜息電位絕對值減小,這樣靜息電位與閾電位水平的電位差減小,心肌細(xì)胞興奮性升高.當(dāng)細(xì)胞外液鉀離子濃度顯著升高時膜內(nèi)外鉀離子濃度差減小,使靜息電位絕對值減小至-55mV ,這樣鈉離子通道失活,心肌細(xì)胞興奮性降低,心肌停搏于舒張狀態(tài)。
4.給蛙心灌入腎上腺素溶液后蛙心搏曲線,可以看出心肌收縮力顯著增強(qiáng),心率也加快.這是因?yàn)槟I上腺素主要與心肌的β1受體結(jié)合，產(chǎn)生正性變時、變力和變傳導(dǎo)效應(yīng).引起強(qiáng)心作用。
5.給蛙心灌入1:10000乙酰膽堿溶液后蛙心搏曲線,可以看出此時心肌收縮力顯
著減弱,心率明顯減慢. 這是因?yàn)橐阴Ｄ憠A與心肌細(xì)胞的M2受體結(jié)合，產(chǎn)生負(fù)性變時、變力和變傳導(dǎo)效應(yīng)。它能提高膜對鉀離子的通透性,促進(jìn)鉀離子外流,使靜息膜電位絕對值增大,心肌興奮性下降,心率減慢。
6.給蛙心灌入3%乳酸灌流H+與Ca2+競爭肌鈣蛋白， Ca2+不能與肌鈣蛋白結(jié) 合，心肌收縮力↓。
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