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利用內(nèi)標為基礎(chǔ)的RT—PCR技術(shù)檢測草莓四種病毒
利用內(nèi)標為基礎(chǔ)的RT-PCR技術(shù)檢測草莓SCV、SVBV病毒
史芳芳
(新疆兵團第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，烏魯木齊 830088)
摘要：草莓皺縮病毒病（SCV）是草莓上為害性最大的病毒病，單獨侵染，影響長勢，與其他病毒復(fù)合侵染時，使感病品種植株嚴重矮化，通常與草莓鑲脈病毒（SVBV）復(fù)合侵染。本研究通過CTAB法與試劑盒提取RNA，以優(yōu)質(zhì)的總RNA為模板，進行梯度PCR，結(jié)合擴增內(nèi)標的檢測體系，建立了優(yōu)化的SCV和SVBV的多重RT-PCR檢測體系，可以對草莓田間植株進行快速穩(wěn)定的病毒檢測。
關(guān)鍵詞: 草莓病毒; 內(nèi)標; 多重RT-PCR; 病毒檢測
Detection of SCV and SVBV with Multiplex RT-PCR Based on
Internal Control
Shi Fang-fang
（The Center of Popularization of Agricultural Technology of the 12th Division of Xinjiang
Production and Construction Corps, Urumchi 830088）
Abstract: Strawberry crinkle virus (SCV) was damage of the largest virus disease.When it was infected alone, it influenced the growth, and other complex virus infection to susceptible cultivars were severe stunting, usually mixed infection strawberry vein banding virus (SVBV) . By CTAB method and the kit, RNA was extracted, using high-quality total RNA as a template, gradient PCR with internal amplification target detection system, established a multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV can fast and stable virus detection in field grown strawberries.
Key words: strawberry virus; internal control; multiplex RT-PCR; virus detection
草莓種苗普遍感染病毒是草莓生產(chǎn)中的瓶頸問題，由于可侵染草莓的病毒經(jīng)常復(fù)合侵染，因此草莓病毒病的田間癥狀表現(xiàn)極其復(fù)雜。不同病毒病在草莓上可表現(xiàn)出相似的癥狀,而同種病毒病在不同條件下的癥狀也會出現(xiàn)很大的差異,這給病害的田間診斷帶來了極大的困難。因此，建立快速、準確的草莓病毒檢測技術(shù)具有重要的實際意義。新疆對草莓病毒病的研究極少，對病毒種類、分布、發(fā)生程度及生物學(xué)特性等基礎(chǔ)極為薄弱，病毒檢測體系不
健全，缺乏先進的種苗及種苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)有效的病毒檢測技術(shù)手段，脫毒種苗質(zhì)量難以保證，退化嚴重，使用時間短，效益不高。有的生產(chǎn)單位未經(jīng)檢測就盲目從內(nèi)地調(diào)種，劣質(zhì)種苗不僅破壞了脫毒種苗的聲譽，市場引起糾紛，損害了農(nóng)民的利益，還造成了一些病原菌的廣泛傳播和地區(qū)性的檢疫病害傳入我區(qū)，后患無窮。因此，我們在已有實驗技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過進一步改進實驗方法，優(yōu)化體系，建立起一套靈敏度高，準確性好，操作簡便的病毒檢測技術(shù)。本研究旨在針對草莓SVBV、SCV兩種病毒，以單一RT-PCR為基礎(chǔ)，通過對反應(yīng)條件和參數(shù)的摸索與優(yōu)化，建立多重RT-PCR檢測方法，實現(xiàn)兩種病毒的同時高效快速檢測，為草莓病毒檢測提供一種方便、高效的分子生物學(xué)方法，為草莓無病毒苗的實際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
草莓試材采自于新疆兵團十二師三坪農(nóng)場種植的露地草莓品種達賽萊克特, 此品種為該單位從外地引進，種苗未經(jīng)檢測便種植于大田，受三坪農(nóng)場之托采集疑似感染皺縮病毒的6株草莓植株葉片，進行病毒檢測。取幼葉一片, 大小約50mg為試驗材料。RNA試劑提取盒 、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量MarkerD2000均購于上海生物工程有限公司。 1.2 試驗方法
1.2.1 特異性擴增與參照引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中SMoV( Genbank Accession No. AJ311875, AJ311876)、SMYEV( Genbank Accession No. D12517)、SCV( Genbank Accession No. AY005146. 1) 、SVBV( Genbank Accession No. NC001725) 的基因組序列和文獻分別設(shè)計和合成針對SMoV、SMYEV、SCV和SVBV 的引物( 表1)。
為了驗證擴增的陰性條帶的真?zhèn)涡? 該研究特引用草莓肌動蛋白基因Actin( GenBank Accession No. AB116565)作為內(nèi)部體系參照。研究中所用引物均由上海生物工程公司合成。 引物序列見表1。
Table 1 The primer pairs for detection of SMoV、SMYEV、SVBV、SCV and Actin
1.2.2 核酸提取
1.2.2.1 利用改進的CTAB法提取草莓葉片總核酸。取少許幼嫩的葉片，放入1.5ml離心管中，
加入石英砂用研磨杵研磨均勻，直至全部研磨至粉末，加入500ul65℃預(yù)熱的CTAB溶液（用前加入2%的巰基乙醇），將裝有CTAB和樣品的EP管放入65℃水浴，約20min。冷卻后，加入500ul的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1=300:288:12)，混勻，12000rpm，離心15min，吸上清，裝入一新的EP管。加入500ul氯仿：異戊醇（24:1=576:24），12000rpm。離心15min吸上清，轉(zhuǎn)入一新的離心管中。加入1/10體積的NaAc（3mol/l），1ml-20℃預(yù)冷的無水乙醇，反復(fù)顛倒數(shù)次，混勻后置于-20℃（-80第一文庫網(wǎng)℃，30min）3-4h，12000rpm，10min棄上清。向離心管中加入75%的乙醇洗滌2-3次，置于吸水紙上倒置晾干。加入DEPC H2O（30ul）溶解。
1.2.2.2試劑盒提取總RNA 參見試劑盒說明書。 1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 按照試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄。 1.2.4 梯度PCR擴增內(nèi)參
以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行單一PCR擴增。
反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃2min; 94℃30s；50-55℃40s；68℃1min, 35個循環(huán)；72℃延伸5min。
1.2.5 多重RT-PCR
1.2.5.1 雙重RT-PCR擴增SCV
反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃2min; 94℃30s；55℃40s；68℃1min, 35個循環(huán)；72℃延伸5min。 1.2.5.2 三重RT-PCR擴增其它三個病毒
反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃2min; 94℃30s；55℃40s；68℃1min, 35個循環(huán)；72℃延伸5min。
2 結(jié)果與分析
2.1 總核酸分離和電泳檢測
采用試劑盒提取總核酸，包括總DNA和總RNA。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出（如圖1），DNA條帶及RNA的28S、18S和5S條帶均能看到，這說明總RNA沒有發(fā)生降解，完整性較好。
2.2 內(nèi)標的RT-PCR
以ActinF/ActinR為引物，采取的草莓品種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，梯度PCR擴增，篩選出53度為最佳退火溫度，擴增出了預(yù)期295 bp大小的特異片段(圖2),說明Actin基因存在于草莓中，該基因適合作為草莓RNA病毒檢測的內(nèi)標。以此基因為內(nèi)標，一方面可以排除假陰性結(jié)果的干擾，另一方面可以進一步檢測RNA質(zhì)量，提高了檢測結(jié)果的準確性。 2.3多重RT-PCR
以ActinF/ActinR、SCVF/SCVR兩對引物首先擴增疑似皺縮病毒，擴增條件同Actin基因，兩個植株擴增出大小為345bp的特異片段（圖3），說明檢測出SCV病毒，此前預(yù)估帶有此病毒的推測是正確的。
同時，以另外三種病毒引物繼續(xù)擴增cDNA，確定植株是否還有其它病毒侵染，結(jié)果檢測出片段大小278bp的條帶，說明存在鑲脈病毒侵染（圖4），因此疑似植株可確定為皺縮病毒和鑲脈病毒復(fù)合侵染，與文獻中所述：皺縮病毒通常與草莓鑲脈病毒（SVBV）復(fù)合侵染的說法一致。
M
1 2 3 4 5 6
圖1 總核酸提取
圖2 6個植株內(nèi)參actin 擴增
M 1
←18s ←28s
←5s
←295bp
M A1 A2 S1 S2
圖3 actin/SCV引物擴增
M: marker
A1,A2:actin擴增條帶 S1，S2：SCV擴增條帶
295bp（actin）
←345bp(SCV)
2
←278bp(SVBV)
圖4 其它3引物擴增 M: marker
1，2:SVBV擴增條帶
3 討論
3.1與改進CTAB法提取RNA 相比，本研究采用試劑盒提取，方法簡單，時間只需半小時，提取效果也比改進CTAB法好，而且改進CTAB法提取配制試劑復(fù)雜，準備工作耗時長，對所用耗材及試劑要求均必須去除RNA酶污染，提取時間需要一天，提取過程也較繁瑣，一批次提取樣品，提取效果均一性不好，有的樣品提取條帶完整，有的則不太好，這說明提取過程稍不注意，則會RNA酶污染，影響了提取效果。
3.2 植物病毒檢測體系中引入內(nèi)標可增加試驗的可靠性，可減少假陰性的出現(xiàn)。本研究中起初設(shè)計了NADH脫氫酶基因為內(nèi)參，合成引物后，經(jīng)過多次條件摸索，始終擴增不出內(nèi)參條帶，之后換成actin內(nèi)參引物，經(jīng)過梯度PCR擴增，一次便成功擴增出條帶，本研究最終選
擇此基因作為內(nèi)參，擴增效果較好，健康植株與帶毒試材均可良好的擴增，說明此內(nèi)標相對穩(wěn)定。
3.3 多重PCR擴增受諸多因素影響，本研究首先以疑似病毒引物和內(nèi)參引物做雙重PCR擴增，確保了樣本RNA質(zhì)量可靠性，同時驗證了疑似病毒的檢測結(jié)果，二次試驗再進行三引物PCR擴增，以排除其它病毒的侵染，兩次實驗便可確保試驗的準確無誤，避免了單一引物擴增的繁瑣性，因此，經(jīng)過多重RT-PCR擴增可縮短試驗時間，減少試劑耗材的損耗，達到了省時省力的功效。同時，本研究在實驗過程中嘗試了一步法RT-PCR進行擴增，此方法可節(jié)省更多的時間和試驗步驟，但此方法中間過程不好控制，并且重復(fù)性不好，因此，沒有得到較好的試驗結(jié)果，最終還是選擇兩步法PCR更能保證試驗的準確性。 參考文獻
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基金項目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團科技支疆計劃項目，項目編號：2013AB006。
作者簡介：史芳芳（1977-），女，碩士研究生,助理研究員。研究方向：植物基因工程�，F(xiàn)從事植物組織培養(yǎng)及農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作，18099666919。 郵箱：451784039@qq.com
單位：新疆兵團第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 地址：烏魯木齊市頭屯河區(qū)崇五路48號，830088
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