多管發(fā)酵法
實(shí)驗(yàn)九 水中總大腸菌群的測(cè)定-多管發(fā)酵法
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>
1、掌握多管發(fā)酵法測(cè)定水中總大腸菌群的技術(shù)。
2、預(yù)習(xí)第二章有關(guān)活性污泥的有關(guān)內(nèi)容。
二、原理
總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法檢驗(yàn)。多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群細(xì)菌能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣以及具備革蘭氏染色陰性,無(wú)芽孢,呈桿狀等有關(guān)特性,通過(guò)三個(gè)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果以最可能數(shù)(most probable number),簡(jiǎn)稱MPN表示。
三、儀器
1.高壓蒸氣滅菌器。
2.恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。
3.生物顯微鏡、載玻片。
4.酒精燈、鎳鉻絲接種棒。
5.培養(yǎng)皿(直徑100mm)、試管(5×150mm),吸管(1、5、10mL)、燒杯(200、500、2000mL)、錐形瓶(500、1000mL)、采樣瓶。
培養(yǎng)基及染色劑的制備:
1.乳糖蛋白胨培養(yǎng)液:將10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中,調(diào)節(jié)溶液pH為7.2—7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混勻,分裝于試管中,于121℃高壓滅菌器中滅菌15min,貯存于冷暗處備用。
2.三倍濃縮乳糖蛋白陳培養(yǎng)液:按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法配制。除蒸餾水外,各組分用量增加至三倍。
3.品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基
(1)貯備培養(yǎng)基的制備:于2000mL燒杯中,先將20—30g瓊脂加到900mL蒸餾水中,加熱溶解,然后加入3.5g磷酸氫二鉀及10g蛋白胨,混勻,使其溶解,再用蒸餾水補(bǔ)充到1000mL,調(diào)節(jié)溶液pH至7.2—7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過(guò)濾,再加10g乳糖,混勻,定量分裝于250或500mL錐形瓶?jī)?nèi),置于高壓滅菌器中,在121℃滅菌15min,貯存于冷暗處備用。
(2)平皿培養(yǎng)基的制備:將上法制備的貯備培養(yǎng)基加熱融化。根據(jù)錐形瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的容量,用滅菌吸管按比例吸取一定量的5%堿性品紅乙醇溶液,置于滅菌試管中;再按比例稱取無(wú)水亞硫酸鈉,置于另一滅菌空試管內(nèi),加滅菌水少許使其溶解,再置于沸水浴中煮沸10min(滅菌)。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液,滴加于堿性品紅乙醇溶液內(nèi)至深紅色再退至淡紅色為止(不宜加多)。將此混合液全部加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi),并充分混勻(防止產(chǎn)生氣泡)。立即將此培養(yǎng)基適量(約15mL)傾入已滅菌的平皿內(nèi),待冷卻凝固后,置于冰箱內(nèi)備用,但保存時(shí)間不宜超過(guò)兩周。如培養(yǎng)基已由淡紅色變成深紅色,則不能再用。
4.伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基
(1)貯備培養(yǎng)基的制備:大學(xué)網(wǎng)于2000mL燒杯中,先將20—30g瓊脂加到900mL蒸餾水中,加熱溶解。再加入2g磷酸二氫鉀及10g蛋白胨,混合使之溶解,用蒸餾水補(bǔ)充至1000mL,調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2—7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過(guò)濾,再加入10g乳糖,混勻后定量分裝于250或500mL錐形瓶?jī)?nèi),于121℃高壓滅菌15min,貯于冷暗處備用。
(2)平皿培養(yǎng)基的制備:將上述制備的貯備培養(yǎng)基融化。根據(jù)錐形瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的容量,用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的2%伊紅水溶液(0.4g伊紅溶于20mL水中)和一定量已滅菌的'0.5%美藍(lán)水溶液(0.065g美藍(lán)溶于13mL水中),加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi),并充分混勻(防止產(chǎn)生氣泡),立即將此培養(yǎng)基適量?jī)A入已滅菌的空平皿內(nèi),待冷卻凝固后,置于冰箱內(nèi)備用。
5.革蘭氏染色劑
(1)結(jié)晶紫染色液:將20mL結(jié)晶紫乙醇飽和溶液(稱取4—8g結(jié)晶紫溶于100mL95%乙醇中)和80mL1%草酸銨溶液混合、過(guò)濾。該溶液放置過(guò)久會(huì)產(chǎn)生沉淀,不能再用。
(2)助染劑:將1g碘與2g碘化鉀混合后,加入少許蒸餾水,充分振蕩,待完全溶解后,用蒸餾水補(bǔ)充至300mL。此溶液兩周內(nèi)有效。當(dāng)溶液由棕黃色變?yōu)榈S色時(shí)應(yīng)棄去。為易于貯備,可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中,臨用前再加水稀釋。
(3)脫色劑:95%乙醇。
(4)復(fù)染劑:將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中,待完全溶解后,加90mL蒸餾水。
四、測(cè)定步驟
1.生活飲用水
(1)初發(fā)酵試驗(yàn):在兩個(gè)裝有已滅菌的50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中(內(nèi)有倒管),以無(wú)菌操作各加入已充分混勻的水樣100mL。在10支裝有已滅菌的5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中(內(nèi)有倒管),以無(wú)菌操作加入充分混勻的水樣10mL,混勻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
(2)平板分離:上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng)24h后,將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基或品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上,置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,挑選符合下列特征的菌落。
①伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上:深紫黑色,具有金屬光澤的菌落;紫黑色,不帶或略帶金屬光澤的菌落;淡紫紅色,中心色較深的菌落。
②品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上:紫紅色,具有金屬光澤的菌落;深紅色,不帶或略帶金屬光澤的菌落;淡紅色,中心色較深的菌落。(3)取有上述特征的群落進(jìn)行革蘭氏染色
①用已培養(yǎng)18—24h的培養(yǎng)物涂片,涂層要薄。
②將涂片在火焰上加溫固定,待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液,1min后用水洗去。
③滴加助染劑,1min后用水洗去。
④滴加脫色劑,搖動(dòng)玻片,直至無(wú)紫色脫落為止(約20—30s),用水洗去。
⑤滴加復(fù)染劑,1min后用水洗去,晾干、鏡檢,呈紫色者為革蘭氏陽(yáng)性菌,呈紅色者為陰性菌。
4.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn):上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無(wú)芽孢的桿菌,則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中(內(nèi)有倒管),每管可接種分離自同一初發(fā)酵管(瓶)的最典型菌落1—3個(gè),然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者(不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論),即證實(shí)有大腸菌群存在。根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽(yáng)性管(瓶)數(shù)查后附表1“大腸菌群檢數(shù)表”,報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。
2.水源水
(1)于各裝有5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中(內(nèi)有倒管),分別加入10mL水樣;于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中(內(nèi)有倒管),分別加入1mL水樣;再于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中(內(nèi)有倒管),分別加入1mL1: 10稀釋的水樣。共計(jì)15管,三個(gè)稀釋度。將各管充分混勻,置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
(2)平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)的檢驗(yàn)步驟同“生活飲用水檢驗(yàn)方法”。
(3)根據(jù)證實(shí)總大腸菌群存在的陽(yáng)性管數(shù),查后附表2“最可能數(shù)(MPN)表”,即求得每100mL水樣中存在的總大腸菌群數(shù)。我國(guó)目前系以1L為報(bào)告單位,故MPN值再乘以10,即為1L水樣中的總大腸菌群數(shù)。
例如,某水樣接種10mL的5管均為陽(yáng)性;接種1mL的5管中有2管為陽(yáng)性;接種1:10的水樣1mL的5管均為陰性。從最可能數(shù)(MPN)表中查檢驗(yàn)結(jié)果5-2-0,得知100mL水樣中的總大腸菌群數(shù)為49個(gè),故1L水樣中的總大腸菌群數(shù)為49×10=490個(gè)。
對(duì)污染嚴(yán)重的地表水和廢水,初發(fā)酵試驗(yàn)的接種水樣應(yīng)作1:10、1:100、1:1000或更高倍數(shù)的稀釋,檢驗(yàn)步驟同“水源水”檢驗(yàn)方法。
如果接種的水樣量不是10mL、1mL和0.1mL,而是較低或較高的三個(gè)濃度的水樣量,也可查表求得MPN指數(shù),再經(jīng)下面公式換算成每100mL的MPN值。
表1 大腸菌群檢數(shù)表
接種水樣總量300mL(100mL2份,10mL10份)
表2 最可能數(shù)(MPN)表
(接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣時(shí),不同陽(yáng)性及陰
性情況下100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值)
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